Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Những khí quan có biểu hiện bệnh tích đặc trưng của bệnh được lực chọn để xác định những biến đổi bệnh lý vi thể. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin và nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) gồm các bước như chuẩn bị, cố định bệnh phẩm, vùi, đúc, cắt dán mảnh và nhuộm HE.
- Chuẩn bị: Mẫu bệnh phẩm gồm khí quản, phổi và thận của gà nghi mắc bệnh IB được đựng trong túi chứa formol 10%, các hóa chất khác gồm máy cắt mảnh Microtom, thuốc nhuộm HE, parafin, xylen ...
- Cố định bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm được ngâm trong môi trường formol 10% với thể tích của formol gấp 10 lần thể tích mẫu trong 12 ngày.
- Vùi bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm được lấy ra khỏi môi trường formol và được cắt nhỏ (chiều dài khoảng 4-5 mm) và cho vào khuôn đúc nhựa. Khuôn đúc sau đó được đặt dưới vòi nước sạch chảy nhẹ trong 24 giờ nhằm rửa sạch formol. Mẫu sau đó được đặt vào máy chuyển đúc tự động trong 18 giờ.
- Đúc block: Bước này nhằm mục đích vùi tổ chức trong môi trường parafin tạo thành một thể thống nhất. Đặt bệnh phẩm vào chính giữa khuôn block theo chiều như mong muốn và nhanh chóng bổ sung parafin lỏng. Khuôn đúc được làm lạnh nhanh bằng cách đặt lên bàn lạnh của máy làm nguội block ở 4oC. Khuôn đúc được làm lạnh từ từ cho tới khi đông cứng là đạt yêu cầu.
- Cắt dán mảnh: Khuôn block sau đó được cắt mảnh bằng máy Microtom với độ dày của mảnh cắt là 3 - 4 µm. Những mảnh cắt đạt yêu cầu sau đó được đặt vào nước lạnh. Một phiến kính sạch, trong, sáng đặt trong nước ấm 50oC được sử dụng để hớt lấy mảnh cắt đặt vào vị trí 1/3 của phiến kính. Phiến kính sau đó được để trong khay ấm nhiệt độ 45oC trong 10 giờ để cố định bệnh phẩm.
- Nhuộm tiêu bản: Mẫu tiêu bản được khử parafin bằng cách cho phiến kính lần lượt qua ba lọ gồm Xylen I trong 6 giờ, Xylen II trong 6 giờ và Xylen III trong 12 giờ. Tiêu bản sau đó được khử Xylen bằng cách ngâm trong cồn 100% hai lần (mỗi lần 1 phút), một lần trong cồn 95%, cồn 70% và cồn 50%. Cuối cùng, mẫu được đặt dưới vòi nước sạch chảy nhẹ trong 15 phút để khử sạch cồn.
+ Nhuộn Haematoxylin (nhuộm nhân): Tiêu bản sau khi được rửa nước được nhỏ ngập thuốc nhuộm Haematoxylin. Thuốc nhuộm sau đó được loại bỏ , rửa sạch bằng nước và vẩy khô sau khi để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Những tiêu bản có xuất hiện màu xanh tím được xác định là nhuộm thành công haematoxylin. Trường hợp nếu tiêu bản nhạt màu có thể nhúng tiêu bản trong môi trường NaHCO3trong 30 giây. Nếu như tiêu bản quá đậm màu có thể nhúng vào dung dịch chứa cồn 96% và HCl 1% trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin (Nhuộm bào tương): Mẫu tiêu bản được nhỏ ngập thuốc nhuộm Eosin trong 10 phút. Loại bỏ thuốc thử Eosin bằng cách rửa tiêu bản bằng vòi nước sạch chảy nhẹ trong 15 phút. Tiêu bản sau đó được ngâm trong hai lọ cồn 100% mỗi lần trong 1 phút. Ngâm tiêu bản trong hai lọ Xylen mỗi lần trong 3 phút để tẩy cồn trong tiêu bản.
- Gắn Baume Canada: Gắn một giọt baume canada lên một lamen sạch, trong, sáng và gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen. Tiêu bản sau đó được ép chặt để loại bỏ bọt khí. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 10X, nếu thấy nhân bắt màu xanh tím và bào tương bắt màu đỏ tươi không có nước và không có bọt khí thì tiêu bản đó đạt yêu cầu.