Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.3. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
3.4.3.1 Tách chiết RNA
Trizol (Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Đức) đã được dụng để tách chiết RNA tổng số trong mẫu bệnh phẩm theo quy trình của nhà sản xuất. Quy trình được mô tả một cách ngắn gọn như sau, 200 µl huyễn dịch chứa mẫu và dung dịch EMDM được bổ sung vào 1 ml Trizol, huyễn dịch được trộn đều trong ống eppendorf 1,5 ml và được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để đảm bảo sự phân tách của các nucleoprotein được hoàn tất. 0,2 ml Chloroform sau đó được được bổ sung đồng thời vào ống eppendorf, đậy nắp và trộn đều bằng cách lắc mạnh trong 15 giây. Huyễn dịch sau khi để ở nhiệt độ phòng 15 phút được ly tâm 12000 vòng/phút (Beckman Coulter, California, USA) trong 15 phút ở 4oC. Dịch nổi được thu lại và chuyển sang một ống eppendorf 1,5ml mới. Isopropanol được bổ sung với một lượng tương đương với phần dịch nổi mới thu nhận. Ống được đậy nắp và lộn ngược ống vài lần sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Dịch nổi được loại bỏ sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. ARN được rửa với 1 ml ethanol bằng cách votex và ly tâm 7500 vòng/phút (Kubota, Tokyo, Japan) trong 5 phút ở 4oC. Sau khi loại bỏ dịch lỏng phía trên, ARN được hong khô tự nhiên bằng cách đặt ống trong buồng cấy trong 10 phút để loại bỏ ethanol. RNA sau đó được hòa tan trong nước cất hai lần. ARN sau đó có thể được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ -20oC.
3.4.3.2. Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA
cDNA được phiên mã ngược sử dụng bộ Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất. Hỗn hợp 20µl gồm 6µl RNA, 4µl nước đã loại RNase, 2 µl dNTPs (10mM mỗi loại), 1µl mồi xuôi, 1µl mồi ngược (200 pM/µl), 1µl RevertAid Reverse Transcriptase (200U/µl), 1µl RiboLock RNase inhibitor (20 U/µl) và 4µl 5x first strand buffer. Hỗn hợp được trộn đều và để trong máy PCR với chu trình nhiệt 25°C trong 10 phút, 42°C trong 60 phút và sau đó 70°C trong vòng 5 phút. Sản phẩm cDNA sau đó được trực tiếp sử dụng hoặc bảo quản ở -20°C.
3.4.3.3. Phản ứng PCR
cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng kit GoTaq® Green Master Mix (Promega, Mỹ). Kit này chứa DNA Taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA. Mồi
(primer) được sử dụng trong nghiên cứu này là các cặp mồi đã được công bố trước đây (Feng et al,. 2012) (bảng 2.2). Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình như sau: 94°C trong 5 phút; 94°C trong 30 giây, 54°C trong 30 giây, 72°C trong 45 giây được lặp lại 30 chu kỳ; 72°C trong 10 phút (bảng 3.3).
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5 Primer Forward 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6
Tổng thể tích 25
Bảng 3.3. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt trong phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
30
Gắn mồi 54 30 giây
Tổng hợp sợi mới 72 45 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.4.3.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 100oC trong vòng 5 phút, làm nguội đến khoảng 60oC. 3 µl thuốc nhuộm Ethidium bromide được bổ sung vào khuôn các lược được
cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bản điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE khoảng 3 - 5mm.
2µl loading dye được trộn đều với vào 8 µl sản phẩm RT-PCR và được chuyển vào các giếng trong bản thạch. 5 µl DNA Marker được điện di đồng thời như một thang chuẩn DNA. Sản phẩm RT-PCR được điện di với nguồn điện có hiệu điện thế 100V cường độ 100mA trong 30 phút. Sau khi chạy điện di xong, kết quả được đọc trên máy phát tia UV. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.