chỉ thị GUS
Nhằm tìm ra vị trí biểu hiện và mức độ hoạt động của gen CR7 ở cây
lúa tiến hành đánh giá sự biểu hiện của gen chỉ thị GUS điều khiển bởi
promoter gen CR7 ở các cây thế hệ T1. Với mỗi dòng chuyển gen lấy 15-20
hạt đem khử trùng và cấy nghiêng 450 trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS với
vị trí phôi hướng lên trên.
Đánh giá mức độ biểu hiện của gen GUS trên toàn bộ cây ở giai đoạn cây
con với các thời điểm: 3, 5, 7 và 14 ngày tuổi. Mỗi dòng lấy 3 cây đem nhuộm
với dung dịch X-Gluc và đánh giá mức độ biểu hiện của GUS.
Đối với việc nghiên cứu sự hoạt động của promoter ở phần gốc thân, tiến hành cắt lát ngang phần gốc thân cây lúa ở thời điểm mức độ biểu hiện
GUS mạnh dựa vào kết quả của thí nghiệm nhuộm toàn bộ cây ở các thời điểm
3.4.4.1. Phương pháp cắt lát ngang phần gốc thân
Chuẩn bị mẫu thực vật:
Cây để cắt tiêu bản được lấy ra khỏi môi trường dinh dưỡng, sau đó cắt bỏ bộ rễ và thân lá, giữ lại phần gốc thân (phần lá được tách chiết DNA phục vụ cho phân tích PCR). Trong trường hợp không tiến hành cắt tiêu bản ngay thì có thể
cố định mẫu bằng dung dịch 0,1M PBS pH 7,2-7,4 để trong tủ 40C .
Chuẩn bị một hộp đá, một đĩa petri bằng thủy tinh. Đánh số thứ tự cây muốn cắt dưới đáy đĩa thủy tinh hoặc ở cạnh của đĩa để tránh bị nhầm lẫn.
Đặt đĩa lên bề mặt phẳng trong đá, đổ dung dịch agarose 4% được đun nóng lên đĩa sao cho lượng thạch vừa đầy đĩa. Nhanh chóng đặt phần gốc thân đã cắt vào vị trí đã đánh dấu, giữ cho phần gốc thân đứng thẳng. Giữ vài giây cho đến khi thạch đông lại.
Tiến hành cắt tiêu bản
Sử dụng máy cắt tiêu bản vibratome Microm HM 650V.
Cắt vuông miếng thạch chứa phần gốc thân, cố định miếng thạch vào vị trí đặt mẫu cắt bằng keo 502.
Chỉnh máy cắt về vị trí cắt 1 và vị trí 2 sao cho phù hợp, điều chỉnh độ dày muốn cắt trên FEED.
Các lát cắt ngang gốc thân được cắt với độ dày 8 µm.
3.4.4.2. Phương pháp nhuộm mô bằng dung dịch X-Gluc
Áp dụng phương pháp nhuộm GUS của Jefferson et al. (1987):
Xử lý mẫu với dung dịch acetone 80%, ủ ở nhiệt độ -200C trong 30 phút.
Loại bỏ dung dịch acetone, thay bằng dung dịch X-Gluc (0,25 mM K3Fe(CN)6, 0,25mM K4Fe(CN)6, 0,015% (v/v) Triton X-100 và 1 mM X-Gluc DMSO) và ủ trong tủ ổn nhiệt ở 37°C, thời gian ủ từ 24h. Sau thời gian ủ, ngâm mẫu vào dung dịch ethanol nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, tiến hành đánh giá mức độ bắt màu ở các vùng cơ quan và chụp ảnh.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN