3.4.1.1. Chuẩn bị mẫu tách chiết RNA
Mẫu lá (khoảng 500 mg) của các dòng lúa chuyển gen pUBi::cdsCR7 và
đối chứng (không chuyển gen) thu từ những cây T0 treo biển đánh dấu được gói vào giấy bạc và ghi nhãn, sau đó nhanh chóng cho vào nitơ lỏng. Mẫu lá được
dùng ngay hoặc cho vào tủ lạnh bảo quản ở nhiệt độ -800C.
3.4.1.2. Tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ lá non của cây lúa 2 tuần tuổi theo phương pháp Trizol LS. Với các hóa chất được sử dụng bao gồm: Trizol LS Reagent, isopropanol, chloroform, ethanol, nước Mili-Q. Quy trình tách chiết được tiến hành như sau:
1. Nghiền mịn 500 mg lá trong nitơ lỏng bằng cối sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 2 ml đã được làm lạnh.
2. Thêm 1,2 ml Trizol LS cho vào mỗi ống, sau đó vortex mạnh. 3. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút.
4. Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 40C trong 10 phút, sau khi ly tâm
xong, hút hết dịch nổi sang ống mới.
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút.
7. Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng ở 40C trong 15 phút.
8. Nhẹ nhàng hút hết dịch nổi phía trên sang ống 1,5 ml mới. Bổ sung 0,75 ml isopropanol lạnh, đảo nhẹ nhàng để dịch được trộn đều.
9. Ủ 30 phút ở -200C (hoặc ủ 10-15 phút ở nhiệt độ phòng). Sau đó ly tâm
với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C, loại bỏ dịch để thu phần kết tủa. 10. Bổ sung 1.2 ml ethanol 75%, vortex nhẹ.
11. Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút ở 40C. Sau đó loại bỏ ethanol để thu phần kết tủa.
12. Hòa tan RNA bằng 50 µl nước Mili-Q, li tâm xuống đáy rồi cho ngay
vào đá. Giữ RNA ở -200C (nếu dùng luôn) hoặc -800C (nếu muốn bảo quản trong
thời gian dài).
RNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% ở 80V trong 30 phút. Soi dưới máy chụp gel để kiểm tra số lượng và chất lượng RNA tách chiết được.
3.4.1.3. Tổng hợp cDNA
RNA sau khi tách chiết được xử lý với DNase I ở 370C trong 10 phút để
loại bỏ DNA. Các mẫu RNA sau khi xử lý DNase I sẽ được thực hiện phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp thành các sợi đôi cDNA. Đối với mỗi mẫu, sử dụng 4 µg RNA tổng số cho 1 phản ứng có thể tích 20µl. Thành phần phản ứng được
sử dụng bao gồm: 5X Reaction buffer (4 µl), Maxima enzym (2 µl), H2O. Chu
trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA như sau: (1) ủ ở 250C trong 10 phút, (2)
sao chép ngược ở 500C trong 54 phút, (3) kết thúc phản ứng ở 850C trong 10 phút. Sau đó pha loãng hỗn hợp xuống nồng độ 0,05 µg/µl.
Sau phản ứng phiên mã ngược, RNA được biến đổi thành cDNA. Trước tiên, sản phẩm phiên mã ngược được kiểm tra thử bằng PCR với cặp mồi đặc
hiệu cho gen actin (bảng 2.1) như là đối chứng dương để kiểm tra sự có mặt của
cDNA. Gen actin mã hóa cho protein actin, một thành phần của bộ khung xương
tế bào, có tính biểu hiện cao. Cặp mồi này được thiết kế sao cho chứa một đoạn intron ở bên trong gen. Bằng cách đó, cặp mồi actin có khả năng nhận biết được
cDNA của gen actin ở kích cỡ gen ước tính là 212 bp, và đồng thời có thể kiểm
tra được sự lẫn tạp của genomic DNA, ở trường hợp này band khuếch đại được có kích thước 369 bp.
3.4.1.4. Phân tích qPCR
Pha thành phần phản ứng qPCR 10 µl/phản ứng (nồng độ 0,02 µg RNA/µl
phản ứng) gồm: 5 µl GoTaq®Green Master Mix, 0,4 µl Primers mix (2 µmol/µl),
0,6 µl H2O, 4 µl cDNA. Thực hiện phản ứng qPCR với chu kỳ nhiệt như sau:
950C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 950C - 2 phút, 550C - 1 phút, 720C - 1 phút;
720C trong 5 phút, hóa chất phát huỳnh quang là SYBR. Kết quả phân tích được
đọc trên máy vi tính và xử lý bằng phần mềm Excel 2013.
3.4.2. Đánh giá sự phân ly di truyền của cấu trúc gen chuyển ở thế hệ T1, T2
3.4.2.1. Chọn lọc dòng lúa T1 mang một copy cấu trúc gen biến nạp
Với mục tiêu chọn được các dòng lúa mang một copy cấu trúc gen biến nạp, các dòng lúa chuyển gen ở thế hệ T1 được đem phân tích. Với mỗi cấu trúc chuyển gen chọn 3-5 dòng chuyển gen T0 để phân tích sự phân ly di truyền bằng
phương pháp PCR. Với mỗi dòng chuyển gen đem gieo 15-20 hạt in vitro vào
môi trường 1/2MS. Sau 1 tuần cắt mẫu lá để tách chiết DNA tổng số để phân tích PCR. Từ kết quả PCR đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền của gen biến nạp theo
phương pháp phân phối Khi bình phương (χ2). Cây dương tính T1 của các dòng
có tỷ lệ phân ly 3:1 được trồng riêng trong từng chậu trong nhà lưới để thu hạt phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Hạt cây T1 nảy mầm trong ống nghiệm được các cây T2, sau đó tiếp tục đánh giá các cây T2.
Gieo hạt in vitro
Hạt được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS với thành phần như trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ 1L môi trường cần pha
Macro MS (20X) 20X 25 ml Micro MS (1000X) 1000X 0,5 ml CaCl2 (100X) 100X 5 ml MS FeDTA (100X) 100X 5 ml Vitamin MS (100X) 100X 5 ml Đường sucrose - 30 g Agar - 7,5 g pH =5,6-5,8
Tiến hành:
- Hạt thóc được bóc vỏ, sau đó khử trùng:
+ Lắc trong dung dịch ethanol 70% trong 1 phút.
+ Ngâm 20 phút trong dung dịch nước Javen (NaClO) 3,8%. + Rửa thật kỹ 6 lần bằng nước cất khử trùng.
Sau khi khử trùng hạt, tiến hành cấy hạt vào trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng đặt trong phòng nuôi cây với thời gian chiếu sáng 12h
sáng/12h tối, nhiệt độ phòng 280C trong khoảng 7-10 ngày.
Tách chiết DNA từ lá lúa
DNA tổng số từ lá cây lúa chuyển gen được tách chiết theo phương pháp của Xin Xu et al. (2005) có cải tiến.
Hóa chất:
-100 ml Dung dịch I gồm: 10g sodium lauryl sarcosine và 100 ml SDS 10%.
-100 ml Dung dịch II gồm: 2 g CTAB, 10 ml 1M Tris-HCl pH 8,0, 4 ml
0,5 M EDTA pH 8,0 và 28 ml 5M NaCl.
-Dung dịch đệm tách chiết được pha trước khi tiến hành tách chiết theo tỷ
lệ 13 Dung dịch I : 7 Dung dịch II. Tiến hành:
-Cắt 1 đoạn lá khoảng 5 cm cây lúa 7-10 ngày tuổi được nảy mầm trong
ống nghiệm.
-Cắt nhỏ đoạn lá lúa cho vào ống eppendorf 2 ml, mỗi ống bổ sung một bi
nghiền, ngâm ống trong nitơ lỏng khoảng 5 phút. Sau đó nghiền mẫu bằng máy lắc.
-Bổ sung 150 µl dung dịch đệm tách chiết, đảo đều và ủ trong bể ổn nhiệt
ở 650C trong 30 phút.
-Ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1.660 g (~ 4.200 rpm) trong 10 phút.
-Bổ sung 20 µl chloroform và lắc nhẹ trong 10 giây, sau đó bổ sung 20 µl
5M kali axetat và lắc nhẹ trong 10 giây.
-Ly tâm 1.660 g ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
-Cẩn thận hút 100 µl lớp dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
-Bổ sung 100 µl isopropanol lạnh, đảo đầu ống vài lần. Làm lạnh 30 phút
ở -200C.
-Loại bỏ dịch lỏng, rửa tủa DNA bằng 200 ml ethanol 70% 2 lần. Mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 3.000g trong 5 phút, sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol.
-Làm khô tủa DNA và hòa tan bằng 50 µl nước Milli-Q hoặc TE có bổ
sung 20 µg/ml RNAase. Ủ 30 phút ở nhiệt độ 370C.
-Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 30 phút.
Phương pháp PCR kiểm tra dòng chuyển gen
Phương pháp PCR được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen
chuyển mục tiêu pUbi::cdsCR7 hoặc proCR7::GUS trong các dòng lúa chuyển
gen với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng là CR7-R/FBUBI và R7-P-F/pcGUS-R, hpt-pc-F/hpt-pc-R.
Thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 20 µl thể hiện lần lượt ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích 1 phản ứng (µl)
Dream Taq Buffer 10X 2
dNTPs 0,2
Primer F 0,5
Primer R 0,5
Dream Taq Polymerase 0,1
MilliQ Water 15,7
DNA 1
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Nhiệt độ (0C) Thời gian
95 5 phút 94 1 phút 30-35 chu kỳ 65 1 phút 72 1 phút 30 giây 72 5 phút
3.4.2.2. Sàng lọc dòng lúa T2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen biến nạp
Từ kết quả chọn lọc những dòng chuyển gen T1 mang một copy cấu trúc gen biến nạp, ở thế hệ T2 tiếp tục tiến hành sàng lọc để tìm ra ít nhất 2 dòng đồng hợp tử độc lập dựa trên mức độ phân ly di truyền. Những dòng chuyển gen T2 đồng hợp tử là những dòng có 100% số cây kiểm tra mang cấu trúc gen biến nạp. Để đơn giản hóa chúng tôi áp dụng phương pháp chọn lọc cây mang gen bằng kháng sinh chọn lọc thực vật (hoặc bằng phương pháp nhuộm X-gluc đối với promoter CR7).
Các bước tiến hành:
- Với mỗi dòng kiểm tra đem gieo 20-30 hạt trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS.
- Sau 3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang môi trường 1/2MS có bổ sung 50 mg/l hygromycin.
- Sau 10 ngày tiến hành đếm số cây kháng (cây sống) và không kháng kháng sinh (cây chết). Tính tỷ lệ cây kháng kháng sinh.
3.4.2.3. Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại
Sau phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở 100V trong 35 phút.
Hóa chất sử dụng: agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0.5X; ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml (EtBr).
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 1 g agarose hòa tan trong 100 ml dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-
600C, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược, ngập khoảng 2/3 chiều
dài răng lược, sau đó để gel đông cứng, rút lược và đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dịch TAE ngập bản gel.
- Tra mẫu và điện di: Sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng với ladder 1 kb để kiểm tra kích thước.
- Nhuộm bản gel: Bản gel được lấy ra từ khuôn, ngâm khoảng 20-30 phút trong dung dịch nước có chứa EtBr, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302 nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel.