4.1.3.1. Kết quả đánh giá hoạt động của promoter CR7 ở giai đoạn cây con
Trước hết tiến hành thí nghiệm đánh giá sơ bộ sự hoạt động của promoter CR7 ở trên toàn bộ cây ở giai đoạn sớm của sự phát triển. Các thời điểm tiến hành đánh giá là: 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 14 ngày tuổi. Hạt của các dòng đồng hợp tử được gieo trên môi trường dinh dưỡng 1/2MS, 15 hạt/dòng: 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 và 34.1.17. Mỗi thời điểm thí nghiệm, ở mỗi dòng lấy 3 cây để xử lý nhuộm với dung dịch X-gluc.
Dòng 2TR7 GUS 10.2.42 (Hình 4.2): Cây ở giai đoạn 3 ngày tuổi có mức
độ biểu hiện GUS mạnh nhất. Sự biểu hiện GUS quan sát rõ ràng ở phần đầu ngọn rễ, vùng gốc thân và bao lá mầm. Ở giai đoạn 5 ngày tuổi, mức độ biểu hiện của GUS giảm dần, gen GUS biểu hiện ở phần gốc thân và phần đầu ngọn rễ cũng giảm dần. Từ giai đoạn 7 ngày tuổi trở đi không còn quan sát thấy sự biểu hiện của GUS.
Hình 4.2. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 10.2.42
a: cây 3 ngày tuổi, b: 5 ngày tuổi, c: 7 ngày tuổi, d: 14 ngày tuổi, bar 1cm
Dòng 2TR7 GUS 11.1.46 (Hình 4.3): Màu xanh lam đặc trưng của GUS
biểu hiện mạnh ở giai đoạn cây 3 và 5 ngày tuổi tại vị trí đầu ngọn rễ và phần gốc thân. Các giai đoạn 7 ngày tuổi và 14 ngày tuổi không quan sát thấy sự biểu hiện của GUS.
Hình 4.3. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 11.1.46
a: cây 3 ngày tuổi, b: 5 ngày tuổi, c: 7 ngày tuổi, d: 14 ngày tuổi, bar 1cm
Dòng 2TR7 GUS 34.1.17: Dòng này có mức độ biểu hiện GUS với cường
độ rất mạnh. Quan sát thấy toàn bộ các bộ phận của cây gồm rễ, gốc thân, lá đều bắt màu xanh đậm khi nhuộm với dung dịch X-gluc (Hình 4.4).
Hình 4.4. Sự biểu hiện của GUS ở dòng 2TR7 GUS 34.1.17
Từ kết quả đánh giá biểu hiện gen GUS ở giai đoạn cây con cho thấy cả 3 dòng đồng hợp tử 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 và 34.1.17 đều có biểu hiện gen
GUS ở phần ngọn rễ và phần gốc thân ở giai đoạn cây 3 và 5 ngày tuổi. Promoter
CR7 được chèn vào genome ở hai dòng 10.2.42 và 11.1.46 có mức độ hoạt động
tương đối giống nhau: quan sát bằng mắt thường thấy rằng GUS biểu hiện ở đầu
ngọn rễ và phần gốc thân giai đoạn 3 ngày và 5 ngày tuổi, giảm dần và mất hẳn
từ giai đoạn cây con 7 ngày tuổi. Dòng 2TR7 GUS 34.1.17 có sự biểu hiện GUS
mạnh nhất, sự biểu hiện của gen GUS duy trì ở cả bộ rễ và thân lá đến giai đoạn
cây 14 ngày tuổi. Có thể dự đoán rằng dòng 2TR7 GUS 34.1.17 có mức độ hoạt động khác biệt là do vị trí chèn trên nhiễm sắc thể của cấu trúc gen
proCR7::GUS khiến biểu hiện của gen GUS được tăng cường.
Như vậy, hai dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46 có phương thức biểu hiện của gen GUS tương tự nhau nên được coi là hai dòng chuyển gen chính
phục vụ cho nghiên cứu đánh giá hoạt động của promoter CR7. Đánh giá bước
đầu cho thấy promoter CR7 hoạt động rất sớm từ giai đoạn phôi nảy mầm. Chủ
yếu hoạt động mạnh tại vị trí gốc thân và ngọn rễ ở giai đoạn cây con trước 7 tuổi
trước khi cây phát triển lá thật đầu tiên. Dự đoán promoter CR7 có thể có chức
năng liên quan đến sự phát sinh rễ phụ và phát triển rễ.
4.1.3.2. Kết quả đánh giá hoạt động promoter CR7 ở bộ rễ
Để làm rõ hơn sự biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ cây 5 ngày tuổi chúng tôi
tiến hành quan sát bộ rễ dưới kinh hiển vi, đồng thời cắt lát ngang rễ để xem xét sự biểu hiện của GUS ở các lớp mô tế bào phía bên trong.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46 có sự
biểu hiện giống nhau ở bộ rễ (Hình 4.5). GUS biểu hiện mạnh ở vùng ngọn rễ ở
cả rễ phụ và rễ chính của cây lúa 5 ngày tuổi (Hình 4.5a, c). Ở giai đoạn này cây mới có được 2-3 rễ phụ, trên rễ chính bắt đầu phát sinh phát triển rễ bên và trên
các rễ bên không quan sát thấy màu xanh của GUS (Hình 4.5b). Quan sát các lát
cắt ngang rễ chính cũng như rễ phụ không ghi nhận sự biểu hiện của GUS (Hình
4.5d, e). Hình 4.5f cho thấy tất cả các tế bào của lát cắt ngang ngọn rễ đều nhuộm màu xanh đậm của GUS. Tại vùng mô biểu bì và trụ bì nơi phát sinh rễ bên
Hình 4.5. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46
a: bộ rễ, b: đoạn rễ có chứa rễ bên, c: chóp rễ, d: lát cắt rễ, e: lát cắt có rễ bên hình thành, f: lát cắt chóp rễ
Tương tự như ghi nhận ở thí nghiệm đánh giá cây con, sự biểu hiện
của GUS ở dòng 2TR7 GUS 34.1.17 có cường độ mạnh hơn nhiều so với 2
dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46. Mức độ biểu hiện GUS của dòng
34.1.17 ghi nhận ở toàn bộ bộ rễ ở tất cả các loại rễ (rễ chính, rễ phụ, rễ bên) (Hình 4.6). Quan sát lát cắt ngang rễ thấy tại vùng trung trụ rễ có sự biểu hiện rõ ràng của GUS.
Như vậy, căn cứ vào sự biểu hiện tương đồng của GUS ở dòng 2TR7 GUS
10.2.42 và 11.1.46 có thể kết luận rằng ở bộ rễ hoạt động của promoter CR7 tập
trung vào vùng mô phân sinh đầu ngọn rễ nơi có tế bào mô phân chia kéo dài rễ và tiếp nhận tín hiệu auxin, không hoạt động trong trung trụ rễ tại mô dẫn cũng
như mô biểu bì, trụ bì. Điều đó cho nhận định rằng gen CR7 có liên quan đến sự
Hình 4.6. Biểu hiện của gen GUS ở bộ rễ của dòng 2TR7 GUS 34.1.17
a: bộ rễ, b: đoạn rễ có chứa rễ bên, c: chóp rễ, d: lát cắt rễ, e: lát cắt có rễ bên, f: lát cắt chóp rễ
4.1.3.3. Kết quả đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 ở phần gốc thân
Tiếp tục đánh giá sự hoạt động của promoter CR7 thông qua sự biểu hiện
của gen chỉ thị GUS tại vị trí gốc thân. Kết quả cho thấy, dòng 2TR7 GUS 10.2.42 có mức độ bắt màu yếu nhất, tại vị trí nốt bao lá mầm có sự bắt màu mạnh nhất với thuốc nhuộm X-gluc (Hình 4.7a). Ở các lát cắt này quan sát thấy rõ màu xanh trong phần trung trụ, đặc biệt tại vị trí phần gốc rễ phụ phôi. Ở phần
nốt gốc thân sự biểu hiện của GUS không nhất quán trong giai đoạn phân hóa
hình thành và phát triển mầm rễ phụ: một số lát cắt biểu hiện một số lát cắt không. Trên những lát cắt có biểu hiện của GUS, màu xanh chỉ xuất hiện ở phần trung trụ của thân cây tại mô mạch dẫn, không ghi nhận biểu hiện một cách rõ ràng ở vùng mô phân sinh phát sinh mầm rễ phụ (Hình 4.7b) và vùng mầm rễ phụ (Hình 4.7c).
Hình 4.7. Lát cắt ngang phần gốc thân của dòng 2TR7 GUS 10.2.42
a: vị trí nốt bao lá mầm, b: giai đoạn phân hóa hình thành mầm rễ phụ, c: giai đoạn kéo dài mầm rễ phụ
Đối với dòng 2TR7 GUS 11.1.46, lát cắt nốt bao lá mầm có biểu hiện
GUS tương tự như dòng 10.2.42 (Hình 4.8a). Tại nốt gốc thân, GUS biểu hiện
với cường độ mạnh hơn dòng 10.2.42, màu xanh đậm tập trung chủ yếu ở phần trung trụ phía trong nội bì. Đặc biệt quan sát thấy màu xanh ở vùng mô phân sinh nằm phía dưới lớp nội bì liền kề với trụ ngoại vi của các bó mạch trong thân cây (Hình 4.8b, c). Biểu hiện ở vùng này kéo đến cả các tế bào phân hóa hình thành mầm rễ phụ khiến cho phần gốc mầm rễ phụ nhuộm màu xanh rất rõ ràng. Tuy nhiên, cũng giống như dòng 10.2.42 GUS không biểu hiện ở vùng mô phân sinh của mầm rễ phụ (Hình 4.8c).
Hình 4.8. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 11.1.46
a: vị trí nốt bao lá mầm, b: giai đoạn phân hóa hình thành mầm rễ phụ, c: giai đoạn kéo dài mầm rễ phụ
Với đặc điểm biểu hiện tăng cường hơn so với 2 dòng trên, dòng 2TR7
GUS 34.1.17 có mức độ biểu hiện GUS rất mạnh ở hầu hết các mô cơ quan ở
vùng gốc thân, bao gồm cả mầm rễ phụ (Hình 4.9).
Hình 4.9. Lát cắt ngang phần gốc thân cây lúa của dòng 2TR7 GUS 34.1.7
a: vị trí nốt bao lá mầm, b, c: giai đoạn phân hóa hình thành mầm rễ phụ
Như vậy, kết quả đánh giá biểu hiện của gen GUS ở phần gốc thân cho
thấy promoter CR7 hoạt động chủ yếu ở phần bó mạch trong thân cây, tại vùng
hình thành các rễ phụ phôi ở nốt bao lá mầm, và tại vùng mô phân sinh cho sự
phát sinh mầm rễ phụ ở các nốt gốc thân. Điều này chứng tỏ rằng gen CR7 có vai
trò nhất định đối với quá trình hình thành rễ phụ phôi và rễ phụ ở cây lúa.
Kết luận: Trong 3 dòng đồng hợp tử thu được, hoạt động của promoter CR7 chủ yếu được đánh giá dựa trên sự biểu hiện tương đồng của hai dòng 2TR7 GUS 10.2.42 và 11.1.46. Kết quả nghiên cứu chỉ cho thấy promoter CR7 hoạt động ở giai đoạn sớm: từ giai đoạn hạt nảy mầm đến khi cây ra lá thật đầu tiên. Promoter CR7 hoạt động chủ yếu tại vị trí gốc thân và mô phân sinh rễ. Trong gốc thân promoter CR7 hoạt động chính ở phần bó mạch trong thân cây, tại vùng hình thành các rễ phụ phôi ở nốt bao lá mầm và tại vùng mô phân sinh cho sự phát sinh mầm rễ phụ ở các nốt gốc thân. Ở bộ rễ hoạt động của promoter CR7 tập trung vào vùng mô phân sinh đầu ngọn rễ. Điều này chứng tỏ rằng gen CR7 có vai trò nhất định đối với quá trình hình thành rễ phụ phôi và rễ phụ, cũng như tham gia vào sự phát triển rễ ở cây lúa.