proCR7::GUS
Đối với các cây lúa chuyển gen, sự kiện chuyển gen xảy ra ở mỗi callus là khác nhau, các cây tái sinh từ mỗi callus sẽ trở thành một dòng chuyển gen độc lập. Cấu trúc gen chuyển được chuyển vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ được chèn vào bất kỳ vị trí nào của bộ genome thực vật với số lượng bản copy khác nhau. Do đó, việc chọn lọc các dòng chỉ chứa một copy cấu trúc gen chuyển là rất cần thiết để đảm bảo rằng sự di truyền và hoạt động của cấu trúc gen chuyển là ổn định ở các thế hệ tiếp theo. Từ đó, việc chọn lọc các dòng đồng hợp tử T2 và việc đánh giá sự hoạt động của promoter trong cây chuyển gen được chính xác hơn.
Mẫu lá của các cây T1 đã được tách chiết DNA tổng số và kiểm tra sự có
mặt của cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS bằng phản ứng PCR với cặp mồi R7-
P-F/GUS-R. Kết quả diện di sản phẩm phản ứng PCR thu được băng mục tiêu với kích thước khuếch đại khoảng 1kb, ở các cây âm tính không xuất hiện băng DNA (Hình 4.1).
Hình 4.1. Kết quả điện di kiểm tra các cây chuyển gen T1
Từ kết quả phân tích PCR thu được thực hiện kiểm định bằng phân phối Khi bình phương (Chi square), dòng chuyển gen có giá trị χ2 < 3,84 thì tuân theo quy luật phân ly di truyền 3:1 của Mendel đối với tính trạng đơn gen, từ đó khẳng
định dòng này mang một copy cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS. Kết quả phân
tích PCR được tổng hợp trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền thế hệ T1 của các dòng chuyển gen proCR7::GUS
STT Dòng chuyển gen T1 Tổng số cây Số cây dương tính Tỷ lệ % cây dương tính χ2 Tỷ lệ phân ly 1 1TR7 GUS 10.2 51 33 64,71 2,88 3:1 2 1TR7 GUS 11.1 49 35 71,43 0,33 3:1 3 1TR7 GUS 16.3 12 17 70,58 0,18 3:1 4 1TR7 GUS 21.2 25 25 100,00 8,33 5 1TR7 GUS 29.4 25 19 76,00 0,01 3:1 6 1TR7 GUS 34.1 24 19 79,17 0,23 3:1 7 1TR7 GUS 39.1 31 21 67,74 0,87 3:1
Kết quả trình bày ở bảng 4.1 cho thấy có 6 trong tổng số 7 dòng phân tích
mang một copy cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS là 1TR7 GUS 10.2, 11.1,
16.3, 29.4, 34.1 và 39.1. Dòng 1TR7 GUS 21.2 có 100% số cây dương tính PCR với giá trị χ2 > χ2lý thuyết (3,84), dự đoán dòng này mang 2 copy cấu trúc gen chuyển nên không phân ly theo tỷ lệ di truyền 3:1. Dòng 1TR7 GUS 21.2 được loại bỏ không tiếp tục đánh giá ở các thế hệ tiếp theo. Các cây dương tính của 6 dòng đã chọn được trồng trong nhà lưới để thu hạt T1.