4.2.1.1. Đánh giá mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây lúa TC65 chuyển gen thế hệ T0
Để đánh giá được mức độ hoạt động của gen CR7 tiến hành phân tích định
lượng mức độ biểu hiện của gen CR7 ở trong các dòng lúa chuyển gen thế hệ T0
bằng kỹ thuật qPCR. Thực hiện đánh giá thông qua hàm lượng mRNA được sinh
tổng hợp ở các dòng lúa T0. Mức độ biểu hiện của gen chuyển CR7 trong các
dòng lúa T0 được so sánh với dòng lúa không chuyển gen đối chứng (TC65),
biểu hiện của gen actin được sử dụng làm gen tham chiếu.
Kết quả phân tích 12 dòng T0 cho thấy 10 dòng có mức độ biểu gen CR7
cao hơn so với đối chứng TC65, là những dòng mang cấu trúc gen pUbi::cdsCR7
(Hình 4.10). Hai dòng 4.1 và 9.1 có mức biểu hiện gen CR7 thấp tương đương
cây TC65 là dòng âm tính. Kiểm tra sự khác biệt giữa các dòng dương tính với cây đối chứng TC65 bằng kiểm định t-test ghi nhận trị số p < 0,05, chứng tỏ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Trong các dòng dương tính, gen CR7 biểu hiện rất mạnh ở dòng TCR7
TC65 22.1 với mức độ biểu hiện gen lớn hơn 15 lần so với gen actin với mức ý
nghĩa 0,01. Một số dòng có mức độ biểu hiện lớn hơn 5 lần bao gồm TCR7 TC65 11.1, 12.1 và 27.1 đều ở mức ý nghĩa 0,01. Các dòng còn lại có mức biểu hiện
yếu hơn, nhưng vẫn cao hơn gen actin. Dựa vào mức độ biểu hiện gen CR7 chọn
ra một số dòng T0 có mức độ biểu hiện từ thấp tới cao để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 4.10. Mức độ biểu hiện gen CR7 ở cây lúa TC65 chuyển gen thế hệ T0
(* mức ý nghĩa 0,05, ** mức ý nghĩa 0,01)
4.2.1.2. Kết quả chọn lọc dòng TC65 mang một copy cấu trúc gen chuyển
Hạt T0 của các dòng được gieo trong ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng 1/2MS. Sau đó, kiểm tra các cây có mang gen chuyển dựa vào sự có mặt
của gen HPT bằng phản ứng PCR với cặp mồi hpt-pc-F và hpt-pc-R, kích thước
khuếch đại là 678 bp. Kết quả điện di hình 4.11 cho thấy nhiều mẫu DNA tách chiết từ lá non của các cây T1 có vạch đặc trưng ở vị trí tương đương với kích thước băng xuất hiện trên giếng của mẫu đối chứng dương là plasmid pc5300 OE CR7 và gần với băng 750 bp trên thang đối chứng. Trong khi đó ở cây đối chứng TC65 và một số cây T1 không xuất hiện vạch băng DNA này.
Kết quả phân tích PCR sự có mặt của cấu trúc gen chuyển dựa trên gen HPT cho thấy tỷ lệ cây T1 dương tính PCR ở 3 dòng đem phân tích gồm 1TCR7 TC65 3.2, 11.1 và 12.1 dao động từ 56,25-80,0% (Bảng 4.3). Phân
tích thống kê bằng kiểm định phân phối Khi bình phương đều có giá trị χ2 <
3,84. Như vậy, các dòng này tuân theo quy luật phân ly di truyền của Mendel đối với gen có 1 alen, chứng tỏ các dòng này chỉ mang một copy cấu trúc gen chuyển. Các dòng T1 được đánh số riêng rẽ và trồng trong nhà lưới để thu hạt,
Hình 4.11. Kết quả điện di kiểm tra cây TC65 chuyển gen ở thế hệ T1
Ladder 1kb, (+) plasmid pc5300OE CR7, (-) TC65
Bảng 4.3. Kết quả chọn lọc dòng TC65 mang một copy cấu trúc gen chuyển
Dòng chuyển gen T1 Tổng số cây Số cây (+) Tỷ lệ % (+) χ 2 Tỷ lệ phân ly 1TCR7 TC65 3.2 20 16 80,00 0,27 3:1 1TCR7 TC65 11.1 24 16 66,67 0,89 3:1 1TCR7 TC65 12.1 16 9 56,25 3,00 3:1
4.2.1.3. Kết quả chọn lọc dòng TC65 mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển
Hạt của các cây dương tính T1 được sử dụng để sàng lọc cây mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển bằng kháng sinh hygromycin. Sau 10 ngày trồng trên môi trường 1/2MS có bổ sung 50mg/l hygromycin những cây không kháng kháng sinh bị chết đen, những cây kháng kháng sinh phát triển hoàn toàn bình thường (Hình 4.12). Kết quả đánh giá tỷ lệ cây sống/chết được tổng hợp trình bày trong Bảng 4.4.
Hình 4.12. Sàng lọc dòng TC65 mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển bằng hygromycin
Kết quả thí nghiệm ghi nhận trong tổng số 12 dòng đem phân tích có 2 dòng cho tỷ lệ cây kháng kháng sinh 100%. Đây là 2 dòng đồng hợp tử độc lập mang cấu trúc gen chuyển: 2TCR7 TC65 11.1.6 và 12.1.17. Hai dòng đồng hợp
tử này được sử dụng phục vụ cho nghiên cứu đánh giá chức năng của gen CR7
liên quan đến sự phát triển bộ rễ.
Bảng 4.4. Kết quả chọn lọc dòng đồng hợp tử locus gen pUbi::CR7 ở cây TC65 chuyển gen thế hệ T2
STT Dòng chuyển gen T2 số cây Tổng Số cây sống Số cây chết Tỷ lệ sống (%)
1 2TCR7 TC65 3.2.7 15 9 6 60 2 2TCR7 TC65 3.2.8 14 12 2 85,71 3 2TCR7 TC65 3.2.11 18 13 5 72,22 4 2TCR7 TC65 3.2.12 16 13 3 81,25 5 2TCR7 TC65 11.1.5 18 15 3 83,33 6 2TCR7 TC65 11.1.6 38 38 0 100 7 2TCR7 TC65 11.1.7 19 11 8 57,89 8 2TCR7 TC65 11.1.8 21 11 10 52,38 9 2TCR7 TC65 12.1.1 20 16 4 80 10 2TCR7 TC65 12.1.2 17 11 6 64,71 11 2TCR7 TC65 12.1.4 14 11 3 78,57 12 2TCR7 TC65 12.1.17 32 32 0 100
4.2.1.4. Kết quả đánh giá kiểu hình bộ rễ các dòng lúa TC65 chuyển gen pUbi::CR7
Thí nghiệm đánh giá kiểu hình bộ rễ trong ống cát được triển khai với: (1) 2 dòng đồng hợp tử là 2TCR7 TC65 11.1.6 và 12.1.17 (gọi tắt là dòng 11.1 và 12.1; (2) 2 dòng âm tính (Null sister) là 2TCR7 TC65 11.1.1 và 12.1.9; (3) giống đối chứng TC65 không chuyển gen (kí hiệu là WT). Sau 4 tuần tuổi, thu mẫu và đánh giá kiểu hình bộ rễ lúa thông qua 2 tính trạng chính là số lượng rễ phụ và khối lượng khô của bộ rễ. Ngoài ra, do thí nghiệm triển khai vào cuối vụ mùa nên cây đẻ nhánh sớm - sau 3 tuần tuổi nên bổ sung thêm chỉ tiêu số nhánh.
Kết quả đánh giá cho thấy số lượng rễ phụ trung bình của 2 dòng đồng hợp tử 11.1 và 12.1 lần lượt là 68,86 và 71,71 rễ/cây, của 2 dòng Null sister lần lượt là 54,3 và 58,63 rễ/cây, của cây WT là 57,56 (Hình 4.13).
Hình 4.13. Số lượng rễ phụ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi
Kết quả kiểm tra bằng kiểm định t-test cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng rễ phụ giữa dòng đồng hợp tử 11.1 so với đối chứng Null sister và WT. Tuy nhiên, ghi nhận sự khác biệt về số lượng rễ phụ giữa dòng đồng hợp tử 12.1 và 2 đối chứng với mức ý nghĩa thống kê 0,01.
Kết quả đánh giá khối lượng khô của bộ rễ cho thấy, khối lượng khô trung bình của bộ rễ dòng 11.1 là 0,094 g lớn hơn so với WT (0,092 g) và dòng Null sister (0,09 g). Đối với dòng đồng hợp tử 12.1 khối lượng khô trung bình của bộ rễ là 0,098 g lớn hơn so với WT và Null sister (tương ứng là 0,091 g và 0,096 g)
(Hình 4.14). Tuy nhiên, sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê, cho nên có thể kết luận là trọng lượng khô bộ rễ giữa các dòng không có sự khác nhau.
Hình 4.14. Khối lượng khô bộ rễ của 2 dòng TC65 chuyển gen ở giai đoạn 4 tuần tuổi
Kết quả so sánh số nhánh cho thấy, cả 2 dòng âm tính Null sister có số nhánh thấp nhất, dòng đồng hợp tử 11.1 có số nhánh tương đương với dòng đối chứng TC65, trong khi đó dòng đồng hợp tử 12.1 có số nhánh cao hơn (Hình 4.15). Tuy vậy, sự khác biệt về số nhánh giữa các dòng không có ý nghĩa thống kê khi phân tích t-test.
Như vậy có thể nhận định rằng ở giai đoạn cây 4 tuần tuổi sự siêu biểu
hiện của gen CR7 đã làm tăng số lượng rễ phụ ở dòng đồng hợp tử 12.1 và không
mang lại sự khác biệt đáng kể về khối lượng khô bộ rễ và số nhánh. Để tăng độ tin cậy của kết quả chúng tôi sẽ lặp lại thí nghiệm và bổ sung thí nghiệm đánh giá sự phát triển bộ rễ ở giai đoạn 6 tuần tuổi.