3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Ong Apis cerana và ong Apis mellifera.
3.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Ảnh hưởng của thuốc bảo vệ thực vật đến ấu trùng ong và ong thợ trưởng thành Apis cerana và Apis mellifera.
3.3. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm NH-06. Trung tâm nghiên cứu ong và nuôi ong nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 15/10/2014 – 15/1/2016.
3.4. VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU
- Thiết bị máy móc: Tủấm, cân phân tích độ chính xác 0.0001%, máy ảnh kỹ thuật số.
- Các dụng cụ: Lồng nhốt chúa, pank, kim chuyển trùng, khay nuôi ấu trùng, pocan, khay nhôm đựng cầu ong, cốc đong nước 200ml, thìa sứ, đũa thủy tinh, giấy bạc, găng tay, mũ lưới che mặt để không bị ong đốt, giấy thấm, sổ ghi chép, bút…
- Hóa chất: Muối K2SO4, đường D-glucoza và D-fructoza, sữa ong chúa, nấm men, nước cất, cồn 70%.
- Một số thuốc hóa học thí nghiệm:
+ Nhóm Lân hữu cơ : Bini 58-40EC (Hoạt chất Dimethoate 95%).
+ Nhóm Carbamate: Ram Supper 750WP (Hoạt chất Imidaccloprid 5% +
Nitenpyram 45% + Pymetrozine 25%).
+ Nhóm Cúc tổng hợp : SecSaiGon 10ME (Hoạt chất Pyrethoide). + Thuốc trừ cỏ : Gesapax 500FW (Hoạt chất Ametryn).
+ Thuốc trừ nấm: Carbendazim 50WP (Hoạt chất Methyl benzimidazol- 2-ylcarbamat).
3.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định tỷ lệ chết của ấu trùng ong mật Apis cerana và Apis melifera
tuổi 2, 3, 4, 5, 6 đối với 5 loại thuốc hóa học ở hai mức nồng độ khuyến cáo và giảm 15% so với nồng độ khuyến cáo trong phòng thí nghiệm.
- Xác định tỷ lệ chết của ong thợ trưởng thành Apis cerana và Apis melifera đối với 5 loại thuốc hóa học ở hai mức nồng độ khuyến cáo và giảm 15% so với nồng độ khuyến cáo trong phòng thí nghiệm.
3.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.1. Phương pháp nuôi ấu trùng
3.6.1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi ấu trùng
Ẩm độđể nuôi ấu trùng ong trong môi trường nhân tạo là 96% (Aupinel et al., 2005).
Bình ẩm độ là bình desiccator có chiều cao h=25cm dùng để duy trì độẩm và có hai phần như sau:
- Phần 1: Có đường kính d1=10cm chứa dung dịch muối K2SO4 bão hòa để tạo độẩm thích hợp cho nuôi ấu trùng
- Phần 2: Có đường kính d2=17cm đểđặt khay nuôi ấu trùng
Hình 3.1. Bình ẩm độ (Desiccator)
Để có ẩm độ 96% cần tiến hành như sau: Đun sôi 300ml nước cất và để nguội đến khoảng 60oC thì đổ vào phần 1 của bình, sau đó từ từ cho tinh thể muối K2SO4 vào và khấy đều cho đến khi muối không còn tan nữa, còn một lớp muối khoảng 1mm ở dưới đáy bình. Đợi dung dịch nguội rồi kiểm tra độ ẩm bằng ẩm kế (Wexler and Hasegawa, 1954; Winston and Bates, 1960).
Phần 2
3.6.1.2. Chuẩn bị thức ăn nuôi ấu trùng
Khẩu phần và chế độ ăn của ấu trùng ong mật nuôi trong điều kiện nhân tạo được thực hiện như trong bảng 3.1:
Bảng 3.1. Khẩu phần thức ăn cho ấu trùng theo các ngày tuổi
(Aupinel et al., 2005)
Ngày tuổi D-glucose (g) D-fructose (g) Nấm men (g) Schúa (g) ữa ong Nước cất (g) 1 0,60 0,60 0,10 5,00 3,70 2 0,60 0,60 0,10 5,00 3,70 3 0,75 0,15 0,15 5,00 3,35 4 2,25 2,25 0,50 12,5 7,50 5 2,25 2,25 0,50 12,5 7,50 6 2,25 2,25 0,50 12,5 7,50 3.6.1.3. Chuẩn bị thức ăn cho ấu trùng tuổi 1 và tuổi 2
Từ công thức về số lượng, thành phần và tỷ lệ phần trăm trọng lượng thức ăn hàng ngày theo tuổi ấu trùng ở bảng 3.1, ta chuẩn bị thức ăn cụ thể cho 30 ấu trùng tuổi 1 và 30 ấu trùng tuổi 2 trong thí nghiệm theo các bước như sau:
- Cân 0,6g D-glucose; 0,6g D-fructose và 0,1g nấm men. Cho hỗn hợp này vào một cốc thủy tinh 10ml (cốc 1).
- Cân 5,0 g sữa ong chúa, cho vào cốc thủy tinh 100ml (cốc 2).
- Đun sôi 5,0 ml nước cất trong 5 phút, khi nước nguội đến khoảng 45- 55°C (đủ mát cho bàn tay chạm vào). Lấy 3,7 ml nước vào cốc 1, khuấy đều cho tan hết.
- Đổ cốc vừa hòa tan cho vào cốc 2 và đánh đều.
Thức ăn cho ấu trùng nên sử dụng trong 3 ngày (bảo quản ở 4°C).
3.6.1.4. Chuẩn bị thức ăn cho ấu trùng tuổi 3
Từ công thức về số lượng, thành phần và tỷ lệ phần trăm trọng lượng thức ăn hàng ngày theo tuổi ấu trùng ở bảng 3.1, ta chuẩn bị thức ăn cụ thể cho 30 ấu trùng tuổi 3 trong thí nghiệm theo các bước như sau:
- Cân 0,75g D-glucose; 0,75g D-fructose và 0,15g nấm men, cho vào một cốc thủy tinh 10 ml (cốc 1).
- Cân 5 g sữa ong chúa, sau đó cho vào cốc thuỷ tinh 10 ml (cốc 2). - Đun sôi 5,0 ml nước cất trong 5 phút, khi nước nguội đến khoảng 45-55 °C (đủ mát cho bàn tay chạm vào). Lấy 3,35 ml nước vào cốc 1, khuấy đều cho tan hết.
- Đổ cốc vừa hòa tan cho vào cốc 2 và đánh đều.
Thức ăn cho ấu trùng nên sử dụng trong 3 ngày (bảo quản ở 4°C).
3.6.1.5. Chuẩn bị thức ăn cho ấu trùng tuổi 4, tuổi 5 và tuổi 6
Từ công thức về số lượng, thành phần và tỷ lệ phần trăm trọng lượng thức ăn hàng ngày theo tuổi ấu trùng ở bảng 3.1, chuẩn bị thức ăn cụ thể cho 30 ấu trùng tuổi 4, 30 ấu trùng tuổi 5 và 30 ấu trùng tuổi 6 trong thí nghiệm theo các bước như sau:
- Cân 2,25g D-glucose; 2,25g D-fructose và 0,2g nấm men, cho vào một cốc thủy tinh 10ml (cốc 1).
- Cân 12,5g sữa ong chúa, sau đó cho vào cốc thuỷ tinh 10 ml (cốc 2). - Đun sôi 10,0 ml nước cất trong 5 phút, khi nước nguội đến khoảng 45- 55°C (đủ mát cho bàn tay chạm vào). Lấy 7,8 ml nước vào cốc 1, khuấy đều cho tan hết.
- Đổ cốc vừa hòa tan cho vào cốc 2 và đánh đều.
Thức ăn cho ấu trùng nên sử dụng trong 3 ngày (bảo quản ở 4°C).
Chú ý: Để tiện cho việc sử dụng và tránh sự hư hỏng thức ăn nuôi ấu trùng ở các ngày tuổi, dùng pipet chia thức ăn vào các lọ thuỷ tinh nhỏ (1 ml). Thức ăn sau khi pha bảo quản ởđiều kiện 4°C và không nên sử dụng quá 3 ngày. Sau khi cho ấu trùng ăn, phần thức ăn còn thừa không được sử dụng lại (Huang, 2009).
3.6.1.6. Phương pháp chuyển ấu trùng vào khay nuôi nhân tạo
Khay nuôi ấu trùng ong trong điều kiện nhân tạo được sử dụng là bản kiểm tra elisa 96 giếng.
Các bước chuẩn bị như sau:
Bước 1 (Làm ấm khay nuôi): Trước khi đặt ấu trùng vào, cần làm ấm khay nuôi bằng cách đặt khay nuôi vào bình ẩm độđã được đặt sẵn trong tủấm.
Bước 2 (Làm ấm thức ăn): Trước khi cho ấu trùng ăn, thức ăn cần được làm ấm lên bằng cách cho lọ thuỷ tinh đựng thức ăn đã pha vào tủ ấm trong thời gian 30 - 45 phút.
Bước 3 (Đưa ấu trùng vào khay nuôi): Chọn cầu ong có sẵn ấu trùng tuổi 1 trong đàn ong khỏe, tiến hành giũ bỏ toàn bộ ong trưởng thành khỏi cầu, đưa cầu ong đó vào phòng thí nghiệm.
Để có ấu trùng tuổi 1 ta tiến hành theo 2 cách như sau:
- Cách 1: Nhốt ong chúa vào trong lồng gắn trên cầu ong trống và đánh vị trí nhốt chúa trên cầu. Chú ý: lồng nhốt chúa làm cho chúa không thể ra ngoài nhưng các ong thợ vẫn có khả năng ra vào trong lồng hay mớm thức ăn cho ong chúa. Nhốt chúa trong 4 – 6 giờ sau đó dỡ bỏ lồng và kiểm tra trứng được đẻ trong các lỗ tổ ở khu vực. Đánh dấu vị trí các lỗ tổ có trứng. Sau 72h trứng nở ta thu được các ấu trùng tuổi 1.
- Cách 2: Quan sát trên cầu ong, những lỗ tổ có ấu trùng nhỏ mà các lỗ tổ gần nó có trứng thì đó là ấu trùng tuổi 1.
Chuyển ấu trùng từ cầu ong sang khay nuôi (di trùng): Dùng kim di trùng đẩy nhẹ lưỡi kim theo sát phần đáy lỗ tổ, múc toàn bộ cả phần sữa và ấu trùng (sữa ở dưới ấu trùng ở trên). Nhẹ nhàng đưa ấu trùng ra khỏi lỗ tổ và đặt vào đáy giếng khay nuôi, bằng cách đẩy từ từ cần trục của kim sao cho phía đầu cần trục đẩy dịch sữa ong chúa ra đồng thời kéo theo ấu trùng nằm trên đó mà không làm tổn thương ấu trùng và nhẹ nhàng rút kim ra. Tuy nhiên, đểấu trùng đạt tỷ lệ sống sót cao, cần phải cho trước khẩu phần ăn lần đầu vào mỗi giếng của khay nuôi.
Chú ý: Các dụng cụ cần được khử trùng bằng cồn 70% và cứ khoảng 10 ấu trùng lại tiệt trùng dụng cụ lấy ấu trùng để tránh lây nhiễm bệnh. Thời gian di trùng càng nhanh càng tốt và nhanh chóng cho khay nuôi vào bình ẩm độđặt trong tủấm.
3.6.1.7. Phương pháp cho ấu trùng ong ăn và dọn thức ăn thừa
Bảng 3.2. Số lượng, thành phần và tỷ lệ phần trăm trọng lượng thức ăn hàng
ngày theo tuổi ấu trùng (Aupinel et al., 2005)
Tuổi ấu trùng (ngày tuổi)
Liều lượng
(µl/ấu trùng) Glucose (%) Fructose (%) Nấm men (%) Sữa ong chúa (%)
1 10 6,0 6,0 1,0 50 2 10 6,0 6,0 1,0 50 3 20 7,5 7,5 1,5 50 4 30 9,0 9,0 2,0 50 5 40 9,0 9,0 2,0 50 6 50 9,0 9,0 2,0 50 Cho ấu trùng ong ăn:
- Làm ấm thức ăn đã chuẩn bị bằng cách cho vào tủấm cho đến khi thức ăn đạt tới 34oC thì bắt đầu tiến hành cho ấu trùng ăn.
- Dùng micro pipet hút một lượng thức ăn vừa đủ theo ngày tuổi như trong bảng 3.2 và bơm vào trong mỗi giếng.
- Đặt đầu micro pipet xuống dưới đáy giếng ở vị trí gần sát với miệng của ấu trùng, từ từ bơm thức ăn để ấu trùng có thể nổi trên thức ăn. Trong quá trình thao tác cần tránh nhỏ thức ăn từ cao xuống, hoặc nhỏ trên mình ấu trùng dễ làm cho ấu trùng bị chết ngạt.
Dọn thức ăn thừa: Lấy bình ẩm độ ra khỏi tủấm, vẫn giữ nguyên khay nuôi ấu trùng trong đó, dùng panh kẹp một ít bông khô và sạch thấm hết thức ăn thừa trong mỗi giếng. Làm nhẹ nhàng tránh gây tổn thương đến ấu trùng (Trong quá trình thấm thức ăn với thao tác quá nhanh sẽ làm ấu trùng bị dính vào bông và dễ dàng bị tổn thương). Đối với ấu trùng chết, lấy panh gắp ấu trùng ra khỏi khay nuôi, lấy bông khô lau sạch giếng sau đó lấy bông thấm cồn lau sạch giếng có ấu trùng chết.
3.6.2. Xác định tỷ lệ chết của ấu trùng ong trong phòng thí nghiệm
- Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp cho ấu trùng ong ăn với thức ăn có chứa thuốc hóa học.
- Thí nghiệm được thực hiện tại mức nồng độ thuốc được khuyến cáo. - Thí nghiệm gồm 5 công thức thuốc và 1 công thức đối chứng (Cho ấu trùng ăn thức ăn không chứa thuốc BVTV). Mỗi công thức thuốc được nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 ấu trùng ong tương ứng với 1 khay nuôi ấu trùng đối với 5 loại thuốc sau: Bini 58-40EC, Ram Supper 750WP, SecSaiGon 10ME, Gesapax 500FW, Carbendazim 50WP.
- Thí nghiệm được tiến hành độc lập ở 2 mức nồng độ khác nhau: Mức nồng độ 1 là nồng độ ghi trên nhãn thuốc, nồng độ 2 là mức nồng độ giảm 15% lượng thuốc so với mức nồng độ 1. Các nồng độ của từng loại thuốc cụ thểđược trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Nồng độ các thuốc hóa học trong thí nghiệm
STT Loại thuốc Hoạt chất Nkhuyồng ếđộn cáo
Nồng độ giảm 15% so với khuyến cáo
1 Bini 58-40EC Dimethoate 0,31 0,27 2 Ram Supper 750WP Cypermethrin 0,09 0,08 3 SecSaiGon 10ME Diflubenzuron 15% + Nitenpyram 45% +
Tetramethrin 25%
0,19 0,16
4 Carbendazim 50WP Methyl benzimidazol-2- ylcarbamat
0,19 0,16
5 Gesapax 500FW Ametryn 1,56 1,33
* Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bịấu trùng đã nuôi tuổi 2.
Bước 2: Pha thức ăn cho ấu trùng tuổi 2 có chứa thuốc BVTV như sau: - Pha thuốc theo nồng độ ghi trên nhãn được dung dịch A.
- Lấy 3,7 ml dung dịch A thay thế cho 3,7 ml nước cất pha thức ăn cho ấu trùng ong. Ta được thức ăn cho ấu trùng tuổi 2 có chứa thuốc hóa học.
- Đối với ấu trùng tuổi 3, 4, 5, 6 ta làm tương tự.
3.6.3. Phương pháp theo dõi
- Từ lúc cho ấu trùng ăn ta thực hiện quan sát sau 24h và 48h.
- Sau đó tiếp tục cho ấu trùng ăn thức ăn không có chứa thuốc hóa học để ấu trùng không bị chết đói.
- Đối với ấu trùng tuổi 3, 4, 5 và 6 thực hiện thí nghiệm tương tự.
3.6.4. Xác định tỷ lệ chết của ong thợ trưởng thành khi thí nghiệm thuốc bảo
vệ thực vật trong phòng thí nghiệm (Laurino et al., 2011)
- Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp cho ong thợ trưởng thành ăn nước có chứa thuốc hóa học ở mức nồng khuyến cáo được trình bày ở bảng 3.3.
- Thí nghiệm có 5 công thức thuốc và 1 công thức đối chứng (Cho ong thợ trưởng thành ăn thức ăn không chứa thuốc BVTV). Mỗi công thức thuốc nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 ong thợ trưởng thành tương ứng với 1 hộp nuôi ong thợ đối với các thuốc sau: Bini 58-40EC, Ram Supper 750WP, SecSaiGon 10ME, Gesapax 500FW, Carbendazim 50WP.
Các Bước tiến hành:
Bước 1: Bắt ong thợ và đểđói trong vòng 2 giờ.
Bước 2 : Chuẩn bị hộp nhốt ong thợ (40cm x 15cm x 15cm) trong chứa các lá đã được làm khô hết hơi nước.
Bước 3: Pha thuốc tại nồng độ khyến cáo theo bảng 3.3
Bước 4: Phun dung dịch chứa thuốc BVTV đã pha ở bước 3 đều lên các mặt lá đã được làm khô hết hơi nước.
Bước 5: Thả ong thợ đã bắt và được để đói cho vào hộp nuôi. Sau 3 giờ thu hết lượng lá trong các hộp nhốt ong. Tiếp tục cho ong ăn thức ăn không chứa thuốc BVTV.
Hình 3.3. Thí nghiệm ong thợ trưởng thành
3.6.4.1. Phương pháp pha thức ăn cho ong thợ trưởng thành
Tạo hỗn hợp siro đường với tỷ lệ 1:1 (Smith, 2000) cho ong thợ trưởng thành ăn theo công thức:
Đường glucose (g) Nước cất (g) Số cá thể ong thợ
15 15 30
•Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị ong thợ trưởng thành.
Bước 2: Pha thức ăn cho ong thợ trưởng thành có chứa thuốc BVTV như sau:
- Pha chế nồng độ thuốc cần thí nghiệm được dung dịch B.
- Từ dung dịch B ta lấy 15,0 ml nước dung dịch hòa với 15,0 mg đường ta được hỗn hợp thức ăn cho ong thợ trưởng thành có chứa thuốc hóa học.
3.6.4.2. Tỷ lệ chết của trưởng thành
Từ lúc cho ong trưởng thành ăn ta thực hiện quan sát sau 24h, 48h và 72h. Sau mỗi lần quan sát ta thay thức ăn không chứa thuốc hóa học cho ong thợ trưởng thành ở tất cả các hộp nuôi để ong thợ không bị chết đói.
3.7. PHƯƠNG PHÁP TÍNH TOÁN VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Xác định tỷ lệ chết của ấu trùng và ong thợ trưởng thành theo công thức tính hiệu lực thuốc Abbott (1925):
Ca - Ta
M(%)= --- x 100 Ca
Trong đó:
M(%): Là hiệu lực thuốc tính theo phần trăm.
Ca: Là số ấu trùng/ong thợ trưởng thành sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm.
Ta: Là số ấu trùng/ong thợ trưởng thành sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm.
- Các số liệu phù hợp được xử lý và tính toán bằng phần mềm Excel 2003 và Irristat.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. TỶ LỆ CHẾT CỦA ẤU TRÙNG ONG NGOẠI (APIS MELLIFERA)
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM TẠI NỒNG ĐỘ KHUYẾN CÁO VÀ
NỒNG ĐỘ GIẢM 15% SO VỚI KHUYẾN CÁO
4.1.1. Tỷ lệ chết của ấu trùng ong Apis mellifera tuổi 2 sau khi ăn thức ăn có
chứa thuốc bảo vệ thực vật
Từ các thí nghiệm đối với ấu trùng tuổi 2 cho ăn thức ăn có chứa thuốc BVTV của các loại thuốc tại nồng độ khuyến cáo và giảm 15% so với khuyến cáo trong điều kiện nhiệt độ 34oC và độẩm 96% thu được bảng kết quả 4.1.