Dụng cụ lấy mẫu:
Dụng cụ lấy mẫu bao gồm: dây và gióng cố định lợn, pank, kéo, syring nhựa, kim tiêm 20, ống falcon, ống eppendorf , bông, cồn, khẩu trang, găng tay, quần áo bảo hộ, tủ lạnh, máy ly tâm, microripet, bình bảo ôn, đá khô,….
Hóa chất: thuốc sát trùng, cồn Ethanol 70%
Máy móc, dụng cụ xét nghiệm:
Máy móc trong phòng thí nghiệm bao gồm: Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường, buồng cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ ấm 370C, tủ sấy, bồn nước ấm, máy li tâm lạnh, máy lắc đĩa, máy lọc, máy cất nước, cân phân tích, máy đo pH, máy rửa đĩa
Phương pháp lấy mẫu, bảo quản mẫu theo quy định tại QCVN 01- 83:2011/BNNPTNT. Mẫu huyết thanh là máu đã được tách bỏ các thành phần hữu hình bằng cách để cho máu đông lại và chắt lấy huyết thanh.
Cố định lợn: Đối với lợn nhỏ, bắt và giữ lợn nằm ngửa. Đối với lợn có trọng lượng cơ thể lớn, dùng dây dù khớp mõm tại chuồng. Xác định vị trí vịnh tĩnh mạch cổ, sát trùng bằng bông cồn Ethanol 70% vị trí lấy mẫu.
Dùng syring nhựa + kim 20 vô trùng lấy máu vịnh tĩnh mạch cổ, mỗi con hút lấy khoảng 5ml máu.
Kéo pittong tạo khoảng trống, bẻ gập kim, đặt ống máu nghiêng một góc 450 và để đông lắng tự nhiên ở nhiệt độ thường (tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào mẫu) khoảng 1-2h để cố định cho máu đông. Sau đó bảo quản ống máu ở nhiệt độ mát (ở 40C) và chuyển đến phòng thí nghiệm.
Cách chắt huyết thanh: ly tâm các ống máu ở tốc độ 1500 vòng/phút trong vòng 10 phút, sau đó chắt huyết thanh sang ống eppendorf vô trùng, ghi ký hiệu mẫu và tiếp tục bảo quản lạnh, theo quy định mẫu máu gia súc được bảo quản lạnh ở 40C.
Sau khi mẫu được ghi ký hiệu sẽ chuyển về phòng thí nghiệm trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, trong trường hợp lấy mẫu nhưng không có điều kiện gửi ngay đến Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương thì mẫu được bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc tủ âm.
Trong trường hợp để lâu, bảo quản huyết thanh ở -200C và tránh lấy huyết thanh ra khỏi tủ lạnh nhiều lần do hiện tượng đông tan sẽ làm giảm hiệu giá kháng thể.
Chú ý: máu không được làm đông lạnh hoặc để bên ngoài quá lâu vì hồng cầu sẽ tự phá hủy. Trường hợp mẫu huyết thanh đã ly tâm tách hết thành phần hữu hình có thể bảo quản ngăn đá tủ lạnh hoặc tủ âm sâu. Huyết thanh đạt yêu cầu phải có màu trong hơi vàng và không có hầu cầu vỡ.
Phạm vi lấy mẫu: lấy mẫu huyết thanh lợn 05 huyện chăn nuôi áp dụng quy trình GAHP theo dự án LIFSAP (huyện Đông Hưng, Kiến Xương, Quỳnh Phụ, Vũ Thư và Thái Thụy) với tổng số mẫu giám sát là 200 mẫu/đợt.
Đối tượng lấy mẫu: là lợn có trọng lượng từ 30-50kg, lợn đã được tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh dịch tả lợn ít nhất 21 ngày.
Năm 2018: lấy mẫu từ ngày 10/05/2018 đến 30/05/2018.
Phương pháp xét nghiệm:
Định lượng kháng thể dịch tả lợn bằng phương pháp NPLA - phản ứng trung hòa kháng thể dịch tả lợn trên môi trường tế bào để đánh giá tỷ lệ bảo hộ của vắc-xin dịch tả lợn sau tiêm phòng (theo TCVN-5273:2010).
Chuẩn bị:
Pha loãng huyết thanh cần chẩn đoán với môi trường MEM có chứa 5% huyết thanh thai bê (không có kháng thể bệnh dịch tả lợn);
Cho một lượng không đổi virus dịch tả lợn (100 TCID50) vào tất cả các giếng (trừ giếng đối chứng)
Cho tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào tất cả các giếng.
Ủ đĩa từ 2-3 ngày ở 370C. Kháng nguyên virus được phát hiện bằng phương pháp nhuộm miễn dịch
Nguyên liệu: kháng thể 1 – Pig polyclonal antibody pha loãng 1/200 trong dung dịch PBS PH=7,2; kháng thể 2 – Anti-pig IgG peroxidase conjugate pha loãng 1/600 trong dung dịch PBS PH = 7,2
• Tiến hành phản ứng
-Chuẩn bị virus cho phản ứng NPLA
Chuẩn bị tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào chai nuôi cấy với lượng 5x104 tế bào/ml trong 15 ml môi trường (EMEM 5% FCS). Ủ đĩa ở 370C/CO2
trong 24 giờ.
Nhiễm virus (100TCID50) vào chai Ủ đĩa ở 370C trong 3-4 ngày
Lưu giữ trong tủ -800C
Làm rã đông và thu lấy môi trường vào ống 15ml Ly tâm 3000g trong vòng 20 phút ở 40C
Thu lấy môi trường bên trên cho vào ống 50ml Chia vào ống nhỏ (200ml/týp). Lưu giữ ở -800C
-Chuẩn độ kháng thể dịch tả lợn bằng phản ứng NPLA trong đĩa 96 giếng: Dùng đĩa 96 giếng, nhỏ 100µl môi trường vào hàng đầu tiên của đĩa, nhỏ 50 µl môi trường vào giếng kế tiếp.
(bớt lại một hàng để chuẩn độ ngược virus và làm đối chứng tế bào)
Pha loãng huyết thanh: cho 10µl huyết thanh vào hàng đầu tiên. Trộn đều và chuyển 50µl sang hàng bên cạnh
Nhỏ dung dịch virus 50µl/giếng vào tất cả các giêngs (trừ hàng cuối cùng). Nhỏ 100µl đối chứng virus pha loãng theo các tỷ lệ: 1; 1/10; 1/100; 1/1000; 1/10000.
Lắc đĩa
Ủ đĩa ở 370C có 4-5% CO2 trong 24 giờ
Nhỏ 100µl tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào tất cả các giếng Ủ đĩa ở 370C có 4-5% CO2 trong 2-3 ngày
-Nhuộm NPLA
Cố định tế bào: đổ bỏ môi trường trong đĩa đi và rửa bằng dung dịch PBS 1% tween 80 từ 2 lần đến 3 lần (200 µl/giếng). Dùng dung dịch cố định PBS 1% tween 20, 10% formaline, 1%NP 40, cho vào mỗi giếng 100µl. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Rửa đĩa 3 lần bằng PBS 1% tween 80.
Cho 50µl kháng thể 2 vào mỗi giêngs, để tủ ấm 370C trong 30 phút Cho 50µl cơ chất ACE vào mỗi giếng, để tủ ấm 370C từ 10 đến 20 phút • Đọc kết quả
-Quan sát đĩa bằng kính hiển vi soi ngược
-Nguyên sinh chất của tế bào bắt phần đỏ đậm (màu của ACE), kết luận không có kháng thể
-Nguyên sinh chất của tế bào không bắt màu (màu hồng), kết luận có kháng thể.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN