Phần I Mở đầu
3.4.Phương pháp nghiên cứu
Phần III Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chuẩn bị bị thì nghiệm
Năm bò đã được bấm số tai theo mẫu: SL01-SL05.
Chuẩn bị thức ăn hàng ngày: Thức ăn được chuẩn bị theo hai mùa (mùa mưa
và mùa khô)
Bảng 3.2 Thức ăn mùa mưa
Loại thức ăn Khối lượng
Cỏ xanh ≈ 35kg/con/ngày
Bảng 3.3 Thức ăn mùa khô
Loại thức ăn Khối lượng
Ủ chua ≈10-15kg/con/ngày
Cám hỗn hợp ≈1,5kg/con/ngày
Cỏ xanh (nếu có) ≈15kg/con/ngày
Cỏ xanh được chúng tơi trồng cách trại khoảng 500m, với diện tích khoảng 3000m2. Hàng ngày, chúng tôi cắt cỏ cho lên xe cải tiến và vận chuyển về trại, phay nhỏ bằng máy phay cỏ.
Chăm sóc bị thí nghiệm
Hàng ngày, bị được tắm rửa sạch sẽ, vuốt ve làm quen để tiện cho công tác lấy máu và điều trị khi cần.
Hình 3.1. Chăm sóc bị thí nghiệm
Phân và nước tiểu của bò được dọn 2 lần/ngày, tồn bộ phân và nước tiểu đó đều được cho xuống hầm biogas để xử lý trước khi thải ra ngồi mơi trường.
Phương pháp phân tích vịng CIDR nhập ngoại từ New Zealand
Phân tích hàm lượng progesterone được tẩm vào vịng CIDR
Mục đích xem vịng CIDR thực tế tẩm bao nhiêu gram progesterone bằng phương pháp Soxhlet và phương pháp trích ly.
Xác định nhóm chức của progesterone
Tạo phổ và chụp phổ quang hồng ngoại xác định cơng thức progesterone nhằm xác định chính xác loại progesterone tẩm vào vịng CIDR.
Phân tích tính chất lý hóa học vịng CIDR
Phân tích rõ tính chất cơ lý hóa học của silicon của vịng CIDR bằng kính hiển vi điện tử quét nhằm xác định chính xác loại silicon cần thiết dùng trong y sinh học.
Phương pháp định lượng progesterone và cortisol trong máu sau khi đặt vòng vào âm đạo bị
Xác định sự có mặt của progesterone và cortisol bằng phản ứng ELISA.
Phương pháp cắt buồng trứng
Phương pháp tạo pha thể vàng ở bò
Gây động dục ở bò để khẳng định bò động rụng và rụng trứng và sau 7 ngày khám thấy có thể vàng tiến hành cắt bỏ buồng trứng (cắt buồng trứng vào thời điểm thể vàng là an tồn nhất vì ít chảy máu). Đây là bị làm thí nghiệm, khơng phải triệt sản để vỗ béo nên bò cần đảm bảo những điều kiện nhất định để tiến hành phẫu thuật như bị khơng ốm, khơng sốt, ăn uống tốt. Nhưng quan trọng nhất là lúc phẫu thuật cắt buồng trứng bò lúc đó bị đang ở chu kỳ thể vàng, vì nếu bị đang động dục, mạnh quản đến nhiều, trao đổi chất nhiều dễ dẫn đến chảy máu trong quá trình phẫu thuật. Do vậy chúng tơi cần gây động dục cho bị, sau khi bị động dục thì 7 ngày thì thể vàng ổn định và lúc này là giai đoạn nghỉ ngơi của chu kỳ động dục và phẫu thuật vào thời điểm này là an toàn nhất.
PGF2
CIDR Phẫu thuật cắt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
buồng trứng Động dục
Tiến hành gây động dục bằng hormone: ngày thứ nhất đặt vòng CIDR vào âm đạo bò bằng applicator đồng thời tiêm GnRH, đến ngày thứ 7 tiến hành rút vòng CIDR và tiêm PGF2α. Ngày thứ 8 tiêm nhắc lại GnRH, sau đó đến ngày thứ 9 hoặc thứ 10 bị có biểu hiện động dục như bỏ ăn, cơ quan sinh dục chảy dịch, niêm mặc âm đạo đỏ… Sau đó 7-10 ngày kể từ khi bị có biểu hiện động dục tiến hành phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng (lúc này là giai đoạn thể vàng nên an tồn ít xuất huyết nội).
Sau một tuần pha thể vàng xuất hiện, tiến hành cắt buồng trứng để hạn chế tối đa việc xuất huyết trong và sau khi phẫu thuật.
Chuẩn bị phẫu thuật
Cố định bị vào gióng sắt 4 trụ chắc, buộc mũi kéo về phía trước, bịt mắt để bị khơng nhìn thấy trong quá trình phẫu thuật, tiến hành buộc đuôi kéo về phía trước để dễ dàng thao tác trong phẫu thuật.
Đi găng tay sản khoa có làm trơn bằng vazơlin tiến hành moi phân và kích thích trực tràng để đi phân hết. Dùng nước và xà phịng rửa sạch hậu mơn và cơ quan sinh dục bên ngồi, sau đó lau khơ và sát trùng bên ngồi bẳng cồn iod. Sau đó tiến hành rửa tử âm đạo bằng dung dịch iod 2% bẳng ống rửa âm đạo.
Tay người mổ rửa bẳng xà phịng kỹ, sau đó sát trùng tay 3 lần bằng cồn trắng và 3 lần bằng cồn iod. Chuẩn bị dao mổ, tiến hành dùng vải gạc vô trùng quấn chặt đầu dao và cán dao mổ chỉ để hở một phần nhỏ mũi dao để đỡ nguy hiểm cho tay người mổ và âm đạo bị trong q trình phẫu thuật.
Thao tác trong phẫu thuật
Dùng ngón tay trỏ và ngón tay cái mở mép âm môn, tay phải cầm dao và cán dao đã được cuốn vải gạc vơ trùng, cầm gọn trong lịng bàn tay, khi đưa tay phải và dao mổ vào trong âm đạo, tiến hành ngửa lòng bàn tay dùng mũi dao cắt dọc phía trên âm đạo gần cổ tử cung (cách cổ tử cùng 2cm) rạch một đường dài khoảng 3- 4cm sau đó bỏ dao mổ ra ngoài và dùng pank đưa vào âm đạo để kẹp làm thủng
tương mạc tử cung sau đó rút pank ra ngồi và đưa tay phải vào, chụm năm ngón tay lại đưa vào vết mổ và xé rộng vết mổ sao cho đưa tay qua vết mổ và tìm buồng trứng bên phải, kéo buồng trứng ra ngoài vào trong âm đạo, lúc này tay trái người phẫu thuật đưa dụng cụ cắt buồng trứng vào trong âm đạo. Dùng tay phải đưa buồng trứng vào thịng lọng xích của dụng cụ cắt và ra hiệu cho người phụ mổ bắt đầu xiết bằng cách kéo ở bên ngồi thơng qua dụng cụ chuyên dụng, khi kéo dần đến nơi, người phụ mổ thắt buồng trứng một cách từ từ đề vừa cắt vừa cầm máu khi buồng trứng bị đứt thì rơi vào lịng bàn tay phải. Sau khi cắt xong, người phụ mổ tiến hành rút dụng cụ cắt bỏ ra và tay phải người mổ chính đưa buồng trứng ra bên ngồi. Và cũng như vậy tiến hành cắt buồng trứng bên trái, sau khi cắt bỏ hai buồng trứng bên phải và bên trái xong. Tiến hành dùng bông cồn tẩm iod sát trùng vào vết mổ âm đạo. Tiến hành dùng kháng sinh 3 ngày liên tục phòng nhiễm trùng kế phát (Sử Thanh Long và cộng sự, 2015). Bảo quản mẫu buồng trứng bằng formol, dán nhãn ghi rõ tên.
Sau phẫu thuật tiêm: Vitamin K: 8ml/con
Amoxicillin 15%: 1ml/10kgP
Hàng ngày tiêm bổ sung Amoxicillin 15%, Ketovet, quan sát tình trạng sức khỏe, đo nhiệt độ bò.
Phương pháp kiểm tra hàm lượng progesterone có trong vịng CIDR
Phương pháp hóa học Soxhlet
Cấu tạo bộ Soxhlet gồm 3 bộ phận chính: Bình ngưng, cốc tràn chứa sản phẩm thử và bình chứa dung mơi chiết.
Tiến hành: Thái mỏng vịng CIDR gói vào giấy lọc cho vào cốc tràn (1). Cho dung mơi vào bình chứa dung môi chiết đun sôi lên. Hơi nước bay lên gặp lạnh đột ngột ở đỉnh bình ngưng tạo nước chảy xuống buồng khai thác, lúc này nhiệt độ trong cốc tràn cao (1) gần như được đun sôi làm tan chảy progesterone tẩm trong vòng CIDR chảy vào ống thu nước xuống bình sơi. Tại đây, tiếp tục bay hơi và cứ liên tục như thế đến khi khối lượng chất lỏng đạt một giá trị cụ thể thì tiến hành lấy (1) ra chạy li tâm dung dịch thu được, còn lại bột mịn đem cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vịng CIDR.
Phương pháp ngâm trích ly trong cồn 900. Dựa vào cơ chế progesterone tan hoàn toàn trong cồn 900, chúng tơi ngâm vịng CIDR trong cồn 900 một thời gian nhất định đủ để progesterone tan hồn tồn. Sau đó lấy vịng CIDR ra cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vịng CIDR.
Phương pháp chạy quang phổ đối chiếu progesterone
Bột tẩm trong vịng CIDR có sẵn trên bề mặt nên chúng tôi dùng dụng cụ chuyên dụng nạo ra, kết hợp với KBr (chất mang) chạy phổ trên máy Quang phổ hồng ngoại.
Progesterone thương mại dự kiến tẩm vào vịng tẩm progesterone cũng chạy tương tự. Sau đó đối chiếu với progesterone trong vịng CIDR.
Nếu có sự trùng hợp thì chọn đúng progesterone.
Phương pháp chụp silicon bằng kính hiển vi điện tử quét
Sau khi trích ly progesterone trong vịng CIDR chúng tôi đem khối silicon cho vào kính hiển vi điện tử quét để phân tích hệ thống lỗ chứa hormone progesterone trong vòng CIDR nhập ngoại tại New Zealand. Kết quả được màn hình hiển thị chụp lại và thể hiện qua hình ảnh.
Phương pháp thiết kế thí nghiệm
0 giờ 3 giờ ngày 1 ngày 9 ngày 13 Lấy máu sau mỗi 24h
Đặt mẫu thử Rút mẫu thử
Từ những bò đã được cắt buồng trứng ta tiến hành đặt các mẫu thử nghiệm vào âm đạo và kiểm tra hàm lượng progesterone trong máu bằng phản ứng enzyme miễn dịch ELISA.
Trước hết cần khám thể trạng toàn cơ thể bò và cơ quan sinh dục bò trước khi đặt mẫu thử nghiệm bằng các dụng cụ sản khoa khám cơ quan sinh dục bị cái. Sau đó, ta tiến hành lấy máu, thụt rửa sạch âm đạo bò bằng cồn iodua 2% và đặt các mẫu thử nghiệm.
Tiến hành nội dung đầu tiên đối với các mẫu thử nghiệm lần lượt là DA, DS, E (tẩm khoảng 1,9g progesterone) và vòng CIDR nhập New Zealand làm đối chứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. Mẫu thử nghiệm và vịng CIDR
Sau khi đặt vòng vào âm đạo bò, tiến hành lấy máu theo các thời điểm, gồm: (1) sau 3 giờ đặt vòng, (2) liên tiếp 9 ngày sau khi đặt vòng, (3) 4 ngày sau khi rút mẫu vịng ra khỏi âm đạo bị thí nghiệm.
Do bị Việt Nam có thể trạng nhỏ, nên chúng tôi tiến hành giảm lượng progesterone tẩm trong mẫu từ khoảng 1,9g xuống khoảng 1,36g. Dự kiến tiếp tục
giảm xuống 1,1g để xác định ngưỡng progesterone tẩm phù hợp nhất đối với đàn bò bản địa. Tuy nhiên, do thời gian đề tài có hạn nên chúng tơi tạm dừng ở mức 1,36g. Mẫu máu được lấy vào các thời điểm gồm: (1) trước khi đặt mẫu, (2) trong thời gian 7 ngày đặt mẫu và (3) sau khi rút mẫu 24h.
Xác dịnh hàm lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm
Khi đã có mẫu vịng ProB hồn chỉnh chúng tơi tiến hành đặt các vịng này vào cơ thể bị nhằm kiểm tra mức độ gây kích ứng và stress với bò. Nếu hàm lượng cortisol trong máu sau khi đặt vịng khơng vượt q 15ngr/ml so với trước khi đặt vịng thì coi như vịng khơng gây stress đối với bò (Sử Thanh Long và cộng sự, 2010).
Hình 3.4. Vịng ProB
Từ những bị thí nghiệm đã được cắt buồng trứng, có tình trạng sức khỏe tốt, chúng tôi tiến hành lấy máu vào mỗi buổi sáng liên tục trong 7 ngày trước khi tiến hành đặt các mẫu vòng ProB để kiểm tra cortisol vào cơ thể bị. Quy trình lấy máu được tiến hành rất cẩn thận và nhẹ nhàng nhằm tránh gây cho bò những kích thích mạnh, rồi lại cho bò nghỉ 7 ngày để bị có thể yên tĩnh và hồi phục lại. Tiếp đó, chúng tơi tiến hành đặt các vịng ProB thử nghiệm tiếp tục lấy máu vào mỗi buổi sáng trong 7 ngày tiếp theo.
Lấy máu sau mỗi 24h Đặt vòng Lấy máu sau mỗi 24h Rút vòng
Ngày 0 (bắt đầu)
Ngày 24 (kết thúc)
Các mẫu máu được bảo quản trong hộp đựng mẫu và chuyển tới trung tâm xét nghiệm thuộc công ty công nghệ và xét nghiệm y học (Medical laboratory and technology company, viết tắt là MEDLATEC) số 42-44 Nghĩa Dũng, Phúc Xá, Ba Đình, Hà Nội để chạy các phản ứng ELISA.
Phương pháp lấy máu bò
Chuẩn bị
Bơm tiêm 5ml
Kim 18 hoặc kim 23. Tốt nhất ta nên dùng kim 23 để lấy máu do chúng ta phải lấy nhiều lần và tĩnh mạch đuôi nhỏ nên khi ta dùng kim 18 dễ làm vỡ tĩnh mạch và ảnh hưởng tới các lần lấy sau.
Bông, cồn 700 Ống đựng mẫu máu
Các bước tiến hành
Buộc cao mũi bị vào gióng
Lắp kim vào xylanh rồi ngậm kim có bao nhựa vào miệng
Đứng với tư thế chân trước chân sau, tay phải cầm bông cồn, tay trái cầm đi bị nâng cao lên.
Dùng bơng cồn sát trùng tại chính giữa đốt thứ 2 của đi, vì tại vị trí này có tĩnh mạch đi chạy qua có kích thước khá lớn.
Cắm kim vng góc với đi cho tới khi chạm vào xương đuôi, hơi rút mũi kim ra và điều chỉnh kim để kim nằm trong lịng mạch.
Mỗi lần lấy khoảng 2ml-3ml máu, sau đó tháo kim khỏi xylanh và cho máu nhẹ nhàng vào ống đựng mẫu máu rồi lắc nhẹ, ghi rõ tên mẫu, giờ lấy máu và ngày tháng lấy máu. Với ống nghiệm lấy máu để chắt huyết thanh cần hết sức nhẹ nhàng, giữ nguyên ống nghiệm ở tư thế nghiêng 450so với mặt đất.
Bảo quản lạnh trong hộp đựng mẫu, mẫu cần được bảo quản ở nơi râm mát, tránh ánh sáng và vận chuyển nhẹ nhàng và cần tiến hành càng sớm càng tốt.
Phương pháp đặt vòng tẩm progesterone
Tuy nhiên, do mẫu vịng chưa có súng thích hợp nên chúng tơi đưa các mẫu vào bằng tay có đi găng tay vơ trùng.
Cố định bị vào gióng, cố định hai chân sau, cố định đuôi, vệ sinh sạch âm môn bằng cồn iodua hoặc cồn 700.
Sử dụng găng tay sản khoa, xoa đều vaselin, rồi cầm các mẫu gọn trong lòng bàn tay.
Nhẹ nhàng đưa tay vào âm đạo cho tới khi chạm tới bên ngoài cổ tử cung, thả mẫu bên trong âm đạo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});