4.2. Nghiên cứu và phân tích vịng nhập ngoại từ New Zealand
Kiểm tra hàm lượng progesterone có trong vịng CIDR
Sau khi tiến hành thí nghiệm bằng phương pháp Soxhlet, chúng tơi cân trọng lượng vịng CIDR có kết quả:
Qua kiểm tra hàm lượng bằng phương pháp Soxhlet cho thấy hàm lượng progesterone trong vòng chiếm 12-15% trọng lượng vòng tương đương 1,3 đến 1,5 gr progesterone. Như vậy, vòng CIDR nhập ngoại từ New Zealand có tẩm khoảng 1,3 gr progesterone, tương đương với bao bì ghi vòng CIDR tẩm 1,38 gram progesterone.
Phân tích lớp phủ silicon qua kính hiển vi điện tử quét
Sau khi trích ly progesterone chúng tôi tiến hành kiểm tra mẫu silicon của vịng CIDR qua kính hiển vi điện tử quét để xác định loại silicon.
Hình 4.4 Lỗ chứa hormone progesterone trong vịng CIDR
Kết quả dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có nhiều lỗ xốp tế vi xếp khá đều trên bề mặt silicon của vịng CIDR, kích thước trung bình khoảng 4µm.
Có lỗ xốp to nhỏ khác nhau là do nhiều bột progesterone đính vào nhau.
Chạy quang phổ đối chiếu progesterone và chụp phổ hồng ngoại bằng máy Quang phổ hồng ngoại
Qua nghiên cứu, chúng tôi nhập mẫu thử progesterone P4 tại Mỹ về để dự kiến tẩm vào vịng tẩm progesterone vì giống với progesterone trong thể vàng tiết ra.
Cơng thức progesterone P4:
Hình 4.5 Cơng thức progesterone P4
Chụp phổ hồng ngoại progesterone của vịng CIDR
Hình 4.6 Phổ hồng ngoại vịng CIDR
Chụp phổ hồng ngoại progesterone dự kiến tẩm vào vòng tẩm progesterone
Đối chiếu hai phổ hồng ngoại cho thấy hormone progesterone trong vòng CIDR trùng với hormone progesterone dự kiến tẩm vào vòng tẩm.
Hình 4.8. Đối chiếu hai phổ hồng ngoại
Qua hình ta có thể thấy phổ hồng ngoại hai là hormone progesterone trong vòng CIDR và hormone progesterone dự kiến tẩm vào vòng tẩm của chúng ta đang nghiên cứu là trùng khớp, sự chênh lệch khác nhau trong hình ảnh chụp quang phổ là do sự chênh lệch nhiệt độ. Tuy vậy, có thể thấy rằng chúng ta đã chọn đúng loại progesterone, có thể dùng loại progesterone P4 này để tẩm vào sản phẩm của chúng ta và đưa các sản phẩm này vào sản xuất thực tế.
4.3. Định lượng progesterone trong máu bị thí nghiệm
Thí nghiệm 1
Tiến hành lấy máu bò trước khi đặt vòng để kiểm tra hàm lượng progesterone trước khi đặt vòng. Sau khi đặt vòng 3 giờ tiến hành lấy máu lần 2, sau đó cứ 24 giờ lấy máu 1 lần cho đến 13 ngày sau. Kết quả thu được như sau
Nồng độ progesterone huyết thanh định lượng bằng phương pháp enzyme miễn dịch (ELISA), kết quả được thể hiện trong bảng 4.2
Bảng 4.2. Hàm lượng progesterone trong máu bị thí nghiệm Thời gian Thời gian Hàm lượng Progesterone (ng/ml) SL-01 Sl-02 Sl-04 Sl-05 Trước đặt vòng 0,232 0,969 0,246 0,1296 Sau 3 h 6,692 10,349 7,874 2,123 1 ngày 3,33 8,616 10,824 4,953 2 ngày 4,406 8,739 10,623 4,296 3 ngày 5,752 6,343 6,3301 1,5881 4 ngày 2,726 8,541 5,261 2,852 5 ngày 0,623 9,154 5,358 3,113 6 ngày 0,3931 6,855 4,3491 2,752 7 ngày 0,318 6,245 3,651 1,211 8 ngày 0,352 7,613 3,044 1,962 9 ngày 0,306 4,274 2,846 1,7201 10 ngày 0,186 2,638 1,808 1,384 11 ngày 0,3491 0,6321 0,358 0,478 12 ngày 0,321 0,286 0,136 0,219 13 ngày 0,274 0,827 0,175 0,259
Qua bảng 4.2 cho thấy trước khi đặt mẫu vào âm đạo bị thí nghiệm, chúng tơi tiến hành lấy máu tất cả các bị để kiểm tra nồng độ progesterone, kết quả cho thấy nồng độ progesterone đạt 0,1296 - 0,969 ng/ml hay nói cách khác là khơng có sự xuất hiện của thể vàng (Cordoba và Fricke 2002; Rivera và cs. 2004), đồng nghĩa với nồng độ progesterone huyết thanh tăng trong thời gian thí nghiệm hồn tồn do thải trừ từ mẫu silicone tẩm. Sau 3 giờ đặt mẫu thí nghiệm, cả 4 mẫu hàm lượng progesterone đều tăng cao, đặc biệt ở mẫu CIDR được đặt vào bò SL-02 tăng cao
nhất đạt 10,349 ng/ml.
Trong q trình thí nghiệm cá biệt có mẫu E được đặt vào bị SL – 01 vào ngày thứ 5 thì hàm lượng progesterone trong máu giảm xuống chỉ đạt 0,623 ng/ml, nhỏ hơn 1 ng/ml, có thể mẫu này silicon hoặc phụ gia khơng đạt nên progesterone đã không được thải trừ.
Sau 9 ngày chúng ta rút các mẫu ra thì ta thấy, thứ nhất, tại bị SL – 01 khơng cịn tìm thấy mẫu E chứng tỏ rằng có thể vào ngày thứ 4 mẫu E đã bị rơi ra ngồi chứ khơng phải silicon hoặc cách tẩm có vấn đề. Thứ hai, vào ngày thứ 10 thì hàm lượng progesterone trong máu tất cả các bò đều giảm xuống dưới 1 ng/ml và liên tục thấp trong 3 ngày sau đó.
Bò SL–01 (mẫu E)
Biểu đồ 4.1. Biến thiên progesterone trong máu bò SL-01
Qua biểu đồ 4.1 có thể thấy rằng trước khi ta đặt mẫu vào thì hàm lượng progesterone trong máu bò SL-01 là rất nhỏ chỉ 0,232 ng/ml. Tuy nhiên, sau khi ta đưa mẫu vào 3 giờ thì hàm lượng đã tăng lên đến 6,692 ng/ml, nhưng sau một ngày kể từ khi đặt mẫu thì hàm lượng đã giảm còn 3,33 ng/ml. Đặc biệt vào ngày thứ 5 thì hàm lượng progesterone trong máu đột ngột giảm mạnh xuống dưới 1 ng/ml, khơng đúng theo dự đốn đó là phải duy trì trên 1 ng/ml cho tới khi rút vòng ra. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bò SL-04 (mẫu DA)
Biểu đồ 4.2. Biến thiên hàm lượng progesterone trong máu bị SL-04
Qua biểu đồ 4.2 ta có thể thấy rằng trước khi đặt mẫu thì hàm lượng chỉ đạt 0.246 ng/ml. Nhưng chỉ sau 3 giờ đặt mẫu DA vào bị thì hàm lượng progesterone đã tăng rất nhanh đạt tới 7,874 ng/ml, đạt cao nhất là 10,840 ng/ml vào ngày thứ nhất và chỉ còn 1,808 ng/ml vào ngày thứ 10. Mặc dù hàm lượng progesterone trong máu chỉ đạt 1,811 ng/ml vào ngày thứ 10 nhưng nó vẫn lớn hơn 1 ng/ml. Vào ngày thứ 11 sau khi rút vịng ra được một ngày thì hàm lượng progesterone giảm mạnh chỉ cịn đạt 0,358 ng/ml và duy trì nhỏ hơn 1 ng/ml liên tục trong các ngày sau đó. Sự giảm đột ngột nồng độ progesterone trong máu có thể là tác nhân làm cho bò động dục trở lại sau khi rút vịng trên bị thí nghiệm (Harpreet Singh và cs, 2006).
Bò SL-05 (mẫu DS)
Qua biểu đồ 4.3 thấy rằng trước khi đặt mẫu thì hàm lượng progesterone trong máu bò rất thấp chỉ có 0,1296 ng/ml nhưng chỉ sau 3 giờ thì hàm lượng progesterone tăng cao tới 2,123 ng/ml, ngày thứ 1 cũng đạt giá trị cao nhất là 4,953 ng/ml. Tuy nhiên đến ngày thứ 3 lại giảm chỉ cịn 1,591 ng/ml, sau đó hàm lượng progesterone lại tăng lên 2,852 ng/ml vào ngày thứ 4 và 3,119 ng/ml vào ngày thứ 5 rồi sau đó lại giảm dần và chỉ cịn 1,7201 ng/ml vào ngày thứ 9. Ngay sau đó, vào ngày thứ 10 khi rút vịng ra thì hàm lượng progesterone tụt xuống dưới 1 ng/ml chỉ còn 1,384 ng/ml. Tuy hàm lượng progesterone có sự biến động lên xuống khơng đều nhưng quan trọng là các giá trị đều trên 1 ng/ml.
Từ các giá trị của các mẫu ta có.
Biểu đồ 4.4. Trung bình 2 mẫu thử
Qua biểu đồ 4.4 ta thấy hàm lượng progesterone trong huyết thanh bò ở các mẫu nghiên cứu đều đạt cao (>1 ng/ml) trong lúc đặt mẫu trong âm đạo. Và nồng độ giảm nhanh khi rút vòng sau 1 ngày (<1 ng/ml) được sự biến giao động giữa của chùm mẫu thử, khoảng dao động này là khá lớn. Ở đây, các giá trị max có thể được coi là đường biến thiên hàm lượng progesterone lí tưởng chúng ta cần còn giá trị min tuy vẫn cao hơn 1 ngr/ml nhưng tương đối là nhỏ nên giá trị không cao. Nếu biến thiên hàm lượng progesterone của vòng CIDR mà giao động trong khoảng từ các giá trị trên thí nghiệm đã thành cơng, cịn nếu biến thiên hàm lượng
progesterone của vòng CIDR mà vượt quá giá trị max thì ta chọn các mẫu nằm trong giá trị từ các giá trị trung bình tới các giá trị của vòng CIDR.
Bò SL-02 (mẫu CIDR)
Biểu đồ 4.5. Biến thiên hàm lượng progesterone trong máu bò SL-02
Ta có thể thấy trước khi đặt hàm lượng progesterone chỉ 0,969 ng/ml nhỏ hơn 1 ng/ml, nhưng khi đặt CIDR vào thì lượng progesterone tăng cao chỉ sau 3 giờ đã đạt 10,349 ng/ml và duy trì cao trên 6 ng/ml cho tới ngày thứ 8 mới bắt đầu giảm dần và xuống còn 2,638 ng/ml vào ngày thứ 10.
Hàm lượng progesterone giảm đột ngột ngay sau rút CIDR ra và đạt 0,633 ng/ml vào ngày thứ 11 và tiếp tục duy trì nhỏ hơn 1 ng/ml.
So sánh sự biến thiên hàm lượng progesterone của các mẫu thử với biến thiên hàm lượng progesterone của vòng CIDR nhập từ New Zealand
Do trên thế giới chưa có một quy chuẩn nào về chất lượng vòng tẩm progesterone nên chúng tơi lấy vịng CIDR nhập từ New Zealand làm chuẩn chất lượng cho vịng thí nghiệm của chúng tơi.
Qua biểu đồ 4.6 ta thấy rằng các mẫu đều có hàm lượng progesterone trong máu thấp dưới 1 ng/ml do các bò này đã được cắt buồng trứng, cá biệt có bị SL-02 có hàm lượng khá cao là 0,970 ng/ml, hàm lượng progesterone trong máu này có được có thể do tuyến thượng thận tiết ra. Tuy nhiên, với hàm lượng này thì vẫn chưa có ý nghĩa trong sinh sản.
Biểu đồ 4.6. So sánh mức độ biến thiên hàm lượng progesterone của các mẫu với vòng CIDR nhập từ New Zealand
Chỉ sau 3 giờ đặt các mẫu vào âm đạo của bị thì hàm lượng progesterone trong máu các bị thí nghiệm đều tăng cao, cao nhất vẫn là vòng CIDR và thấp nhất là mẫu DS. Hàm lượng progesterone trong máu các mẫu đều giảm đột ngột sau rút các mẫu thử ra ngoài.
Qua đồ thị ta cũng thấy rằng chỉ có mẫu DA đặt vào bị SL-04 là có đồ thị lý tưởng nhất trong 3 mẫu đặt vào bị.
Thí nghiệm 2
Đối với nội dung thí nghiệm 2, sau khi giảm hàm lượng progesterone tẩm trong mẫu từ khoảng 1,9g xuống khoảng 1,36g, chúng tôi thu được kết quả như bảng 4.3
Ngày xét nghiệm SL01 SL02 (CIDR) SL04 SL05
Trước khi đặt mẫu 1.07 0.28 0.76 1.41
30 phút sau đặt mẫu 10.55 17.75 3.78 3.93 24h 4.74 8.92 7.29 13.65 48h 5.03 6.91 8.76 4.5 72h 4.83 4.89 4.44 3.44 96h 5.31 6.15 4.11 2.71 120h 2.64 3.31 4.67 2.03 144h 2.35 3.65 4.76 2.05 168h 2.1 5.79 4.6 1.44
Biểu đồ 4.7. Nồng độ progesterone huyết thanh trong máu bị thí nghiệm khi đặt mẫu vịng tẩm khoảng 1,36g progesterone và mẫu vòng CIDR (tẩm 1,9g
progesterone).
Từ biểu đồ cho thấy, nồng độ progesterone huyết thanh của 4 bị thí nghiệm đều ở dưới 1ng/ml, sau khi đặt vòng 30 phút progesterone được thải trừ từ vịng nhanh chóng xuất hiện trong máu, làm cho nồng độ progesterone huyết thanh tăng cao, điển hình là bị đối chứng đặt vòng CIDR (17,75ng/ml) và bò SL01 (10,55ng/ml). Harpreet Singh và cs (2006) quan sát thấy nồng độ P4 đạt đỉnh sau 1 ngày đặt vòng trên bò Sahiwal (13,94). Kết quả tương tự cũng được Burke và cs (1999) thu được với nồng độ đạt 10 ng/ml sau 2 giờ đặt vịng trên bị thí nghiệm. Kết quả của chúng tôi trong nghiên cứu này không khác biệt so với các nghiên cứu đã được thực hiện truớc đó, khi nồng độ progesterone trong máu bị thí nghiệm tăng nhanh sau khi đặt vòng và đạt đỉnh trong 24 giờ.
Suốt q trình 7 ngày đặt vịng, nồng độ progesterone huyết thanh tiếp tục được duy trì ở mức cao. Nồng độ đỉnh ở bị SL04 đạt 8,76ng/ml (vào ngày thứ 2), bò SL05 đạt 13,65ng/ml (vào ngày thứ 3). Sau khi rút vòng 24h, nồng độ progesterone ở tất cả các bò giảm xuống mức sinh lý như trước khi đặt vịng (0,17- 0,68ng/ml).
Ngoại trừ bị SL05 ở thí nghiệm 1 bị rơi mẫu tẩm ra ngồi trong thời gian thí nghiệm, so với kết quả từ thí nghiệm đầu tiên khi sử dụng vòng tẩm khoảng 1,9g
progesterone, các bị ở thí nghiệm 2 có nồng độ progesterone đỉnh cao hơn. Tuy nhiên, sau khi rút vòng nồng độ progesterone huyết thanh các bị ở cả 2 thí nghiệm đều nhanh chóng giảm xuống dưới 1ng/ml. Kết quả này chứng tỏ mẫu vòng tẩm 1,36 gr progesterone cũng đem lại hiệu quả tương đương mẫu vòng tẩm 1,9g progesterone. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong thời gian tới, chúng tôi tiếp tục giảm lượng progesterone tẩm trong mẫu vòng xuống mức 1,0gr để có thể so sánh sự khác biệt giữa các ngưỡng progesterone tẩm, từ đó kết luận ngưỡng phù hợp nhất đối với đàn bò ở Việt Nam.
1. Định lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm
Kiểu dáng vịng ProB được chúng tôi thiết kế theo kiểu chữ “T”. Do vậy chúng tơi tiến hành kiểm tra cortisol xem bị có bị stress khi đặt vịng khơng.
Trước đặt vòng ProB
Bảng 4.3 Hàm lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm trước khi đặt vịng ProB
(ng/ml) Ngày 1 2 3 4 5 6 7 S ố ta i b ò SL01 10,8 13 6,8 17 3,2 7,9 8,8 SL02 3,9 32,6 6,2 3,2 1,7 2,2 7,6 SL03 9,7 12,4 3,0 5,1 5,4 4,4 6,5 SL04 7,6 3,2 5,0 6,8 9,9 3,0 24,5 SL05 2,7 2,9 1,6 4,4 1,6 6,9 3,6
Biểu đồ 4.8. Biến thiên hàm lượng cortisol trong máu các bị thí nghiệm trước khi đặt vịng ProB
Từ bảng 4.3 và biểu đồ 4.8 ta có thể thấy rằng hàm lượng cortisol trong máu bò là tương đối thấp, trên đa số bị thì hàm lượng cortisol trong máu đều nhỏ hơn 15 ng/ml điều đó chứng tỏ rằng bị thí nghiệm khá tốt, khơng bị rơi vào trạng thái stress. Tuy nhiên, vào ngày thứ 2 bị SL-02 có hàm lượng cortisol tăng lên 32,6 ng/ml và ngày thứ 7 bò SL-04 hàm lượng cortisol tăng lên 24,5 ng/ml nhưng khơng duy trì nên chưa gây stress cho bị, điều này có thể do trong q trình lấy máu đã làm cho các bị này bị kích thích làm hàm lượng cortisol tăng lên.
Từ đây ta có
Biểu đồ 4.9. Biến thiên hàm lượng cortisol trung bình trong máu các bị thí nghiệm trước đặt vịng ProB
Qua biểu đồ 4.9 thấy rằng hàm lượng cortisol trong máu trung bình của các bị thí nghiệm thấp, tất cả đều dưới 15 ng/ml chứng tỏ các bị thí nghiệm khá ổn định và khơng bị stress.
Trong đặt vịng ProB
Bảng 4.4 Hàm lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm trong khi đặt vòng ProB
(ng/ml) Ngày 1 2 3 4 5 6 7 S ố ta i b ò SL01 7,6 3,5 47,0 11,2 7,0 3,2 3,4 SL02 6,5 1,9 12,3 7,9 6,6 1,5 2,1 SL03 8,2 13,4 16,5 9,9 9,5 9,6 4,7 SL04 17,9 4,4 17,9 17,1 7,8 3,8 5,4 SL05 1,5 1,8 4,6 1,9 6,6 4,1 2,0
Biểu đồ 4.10. Biến thiên hàm lượng cortisol trong máu của các bị thí nghiệm trong khi đặt mẫu vòng ProB
Từ bảng 4.4 và biểu đồ 4.10 ta có thể thấy rằng vào ngày thứ 3 thì hàm lượng cortisol trong máu bị SL-01 đột nhiên tăng cao lên tới 47 ng/ml, tuy nhiên khơng duy trì nên có thể là do q trình lấy máu hoặc cơng tác chăm sóc đã ảnh hưởng tới bò làm bò bị phản ứng. Nhưng nhìn chung trong khi đặt vòng ProB hàm lượng cortisol trong máu bò cũng tương đối thấp, đa số nhỏ hơn 15 ng/ml có nghĩa là các bị thí nghiệm khơng bị rơi vào trạng thái stress.
Biểu đồ 4.11. Biến thiên hàm lượng cortisol trung bình trong máu của các bị thí nghiệm sau đặt vịng ProB
Từ biểu đồ ta thấy được rằng trong khi đặt vịng ProB thì hàm lượng cortisol trung bình trong máu bị vẫn tương đối thấp, hầu như nhỏ hơn 15ng/ml chỉ có ngày thứ 3 trong khi đặt vịng thì hàm lượng cortisol có cao hơn 15 ng/ml, nhưng không kéo dài chứng tỏ không liên quan đến việc đặt vịng ProB mà có thể là do cơng tác lấy máu đã làm bò hoảng loạn.
Biểu đồ 4.12. So sánh hàm lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm trước và trong đặt vịng ProB
Từ biểu đồ 4.12 có thể thấy rằng hàm lượng cortisol trong máu bị thí nghiệm trước và sau khi đặt vịng ProB khơng thay đổi nhiều và hầu như đều nhỏ hơn 15