5. Những đóng góp mới của đề tài
1.3. Tình hình sử dụng eCG trong hỗ trợ sinh sản ở động vật
Các nhà nghiên cứu bắt đầu phát triển các chế phẩm gonadotropin vào năm 1910, khi các bằng chứng thực nghiệm cho thấy rằng tuyến yên có vai trò điều chỉnh chức năng của tuyến sinh dục. Zondek và Ascheim (1927), đã chứng minh rằng trong máu và nước tiểu của phụ nữ mang thai chứa một chất kích thích tuyến sinh dục có khả năng gây ra sự trưởng thành của nang noãn và sự hình thành thể vàng khi tiêm vào chuột chưa trưởng thành. Chất này được chứng minh là hCG, được sản xuất trong mô nhau thai của lá nuôi hợp bào (syncytiotrophoblast) [21]. Sau đó, sản xuất hCG trong ống nghiệm có thể được thực hiện thông qua nuôi cấy mô nhau thai, và hCG thương mại lần đầu tiên có mặt vào năm 1931 [21].
Một số thử nghiệm đã chứng minh rằng gonadotropin chiết xuất từ máu của ngựa cái mang thai (PMSG, eCG) và từ tuyến yên của người chết (hPG) gây ra phản ứng buồng trứng, nhưng phản ứng kích thích rụng trứng hoàn toàn lại không đồng nhất [21]. hPG và eCG đã được sử dụng ở cả Châu Âu và Hoa Kỳ cho đến đầu những năm 1960, mặc dù phát hiện ra rằng các phương pháp
điều trị như vậy tạo ra các kháng thể trung hòa (anti-hormones) khiến buồng trứng không phản ứng với kích thích lặp lại [21].
Các nghiên cứu sử dụng điều trị bằng gonadotropin huyết thanh của ngựa mang thai (PMSG, eCG) và gonadotropin màng đệm ở người (hCG) hoặc một mình hoặc kết hợp đã được đánh giá dựa trên trọng lượng buồng trứng và tử cung; sự phát triển nang trứng, rụng trứng và số lượng trứng rụng đã được tiến hành từ rất sớm. Lunn và Bell (1968) đã công bố sự kết hợp cả eCG và hCG có khả năng gây rụng trứng. Sự kiện này có liên quan với sự kích thích tử cung nhưng thường xảy ra trong trường hợp không đánh dấu sự tăng trọng lượng buồng trứng hoặc xuất huyết nang. Tác dụng của eCG và hCG gây rụng trứng trên một phạm vi rộng của cả hai liều lượng kích thích tố. Với liều thấp của PMSG số lượng trứng tạo ra là độc lập với liều hCG.
Corbin và McCabe (2002) đã kiểm tra phản ứng của các nhóm chuột khác nhau để đề xuất phương pháp điều trị nội tiết tố gây siêu rụng trứng. Chuột cái chưa trưởng thành Sprague Dawley (SD), FBN1 và F344 (30 đến 35 ngày tuổi) đã được sử dụng cho nghiên cứu này. Động vật từ mỗi dòng được phân thành bốn nhóm của phương pháp điều trị nội tiết tố như sau:
1) 30 IU PMSG, sau 52 giờ với 25 IU HCG; 2) 15 IU PMSG, sau 52 giờ với 7.5 IU HCG;
3) 1.0 IU FSH mỗi ngày qua kim tiêm Alzet trong 60 giờ; 4) 1.0 IU FSH và 54 giờ tiếp theo là 10mg LH.
Hiệu quả của phương pháp điều trị nội tiết tốt được đánh giá qua các tiêu chí: tỷ lệ giao phối, tỷ lệ rụng trứng, tổng số trứng rụng ở mỗi con cái và tỷ lệ thụ tinh. Nghiên cứu đã cho thấy, điều trị bằng eCG + hCG là một phương pháp hiệu quả gây phản ứng siêu rụng trứng ở hầu hết các tiêu chí kiểm tra. Kết quả của nhóm tác giả cho thấy, các chủng chuột khác nhau có nhiều mức độ nhạy
cảm và phản ứng với các giao thức khác nhau của hormone siêu rụng trứng [40]. Đây chính là cơ sở khoa học để thực hiện nghiên cứu nhằm xác định liều lượng sử dụng kích dục tố thích hợp trên các đối tượng khác.
Nhằm đánh giá hiệu quả việc sử dụng eCG thay thế cho FSH, Popova et al. (2002) đã thực hiện các giao thức gây siêu rụng trứng bằng cách sử dụng tiêm đơn eCG hoặc FSH được so sánh ở chuột Sprague Dawley (SD) chưa trưởng thành. Các tiêu chí theo dõi bao gồm: tổng số trứng thu được, tỷ lệ thụ tinh, phôi phát triển in vitro, độ nhạy của các hợp tử trong việc đưa DNA ngoại lai vào nhân và sự phát triển trong cơ thể của chúng sau khi cấy ghép vào ống dẫn trứng của các thể nhận. Những con chuột SD cái được kích thích bằng 15 IU eCG hoặc FSH 10m sau khi tiêm HCG ở liều 20 và 30 IU cho mỗi cá thể. Kết quả của nghiên cứu này chứng minh rằng việc điều trị trên chuột SD chưa trưởng thành của eCG có hiệu quả tương đương điều trị bằng FSH và do đó thích hợp hơn cho công nghệ chuột chuyển gan do chi phí thấp hơn và dễ xử lý hơn [42].
Để xác định liều lượng điều trị nhằm thực hiện tối ưu hóa siêu rụng trứng ở chuột, Cornejo-Corte at al. (2006) đã tiến hành nghiên cứu nhằm sản xuất một số lượng lớn các phôi có chất lượng tốt phù hợp để phát triển các tế bào gốc phôi chuột (RES). Nhóm tác giả đánh giá động học rụng trứng của ba chủng chuột: Wistar, Fisher và ACI/N. Động vật thí nghiệm được điều trị bằng 50 IU eCG và 50 IU hCG sau 50 giờ. Tiếp theo, nhóm tác giả đánh giá các đường cong đáp ứng liều của eCG và hCG ở chuột Wistar để có được số lượng cao nhất của phôi. Các thông số đánh giá cho khả năng siêu rụng trứng là: tỷ lệ phần trăm của chuột cái đã giao phối, tỷ lệ chuột cái mang thai và số lượng trung bình của phôi thu được trên mỗi con. Kết quả của những thí nghiệm chỉ ra rằng kết hợp liều tốt nhất là 50 IU cho mỗi loại hormone. Thí nghiệm sau đó,
nội tiết tốt kết hợp (30/30, 30/50, 50/30, 50/50 IU eCG/hCG) để tạo ra số lượng phôi đạt chất lượng nhiều nhất. Chất lượng phôi được đánh giá theo các tiêu chí: phôi phát triển đồng nhất, hình thái phôi thai, sự sống của phôi trong tử cung và phôi trong ống nghiệm có khả năng cấy ghép. Kết quả của những thí nghiệm cho thấy 30/50 IU eCG/hCG là liều điều trị tạo ra chất lượng phôi tốt nhất [41].
Ở Việt Nam, Trần Tiến Dũng (2004) đã sử dụng kết hợp hormone sinh sản eCG và hCG để điều trị hiện tượng chậm động dục lại sau đẻ ở lợn nái ngoại trên hai giống Yorshire và Landrace. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ lợn nái động dục sau đẻ chiếm 80%, thời gian động dục, tỷ lệ thụ thai, số con trên lứa của những con nái khỏi bệnh đều đạt yêu cầu. Với phác đồ điều trị eCG 3000 đvc/nái, nếu động dục tiêm tiếp HCG 1000 đvc/nái cho kết quả tốt với thời gian động dục lại sau đẻ 5,8 ngày, tỷ lệ thụ thai 91,67%, số con sinh ra trên lứa 9,8 con. Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Thanh Bình (2009) đã đánh giá ảnh hưởng của liệu pháp hormone bằng cách đặt vòng PRID (chứa progesterone) đến khả năng điều trị rối loạn sinh sản ở bò cái sinh sản kém, kết quả cho thất quy trình đạt hiệu quả tốt. Đỗ Văn Thu và cs. (2013) đã sử dụng kết hợp eCG và Prosolvin (PGF2α) để gây động dục hàng loạt kết hợp với thụ tinh nhân tạo nhằm nâng cao năng suất và chất lượng đàn bò trên hai giống bò vàng và bò lai Sind. Với quy trình tiêm bò hai mũi PGF2α (2ml) cách nhau 11 ngày kết hợp tiêm eCG (500 IU) ở mũi thứ hai, xác định tỷ lệ thụ thai bằng phương pháp khám thai qua trực tràng. Kết quả cho thấy rằng cho tỷ lệ động dục là 84,9%, tỷ lệ thụ thai 82,88% và tỷ lệ đẻ đạt 93,52%. Để gây siêu bài noãn trên bò, Hoàng Nghĩa Sơn và cs. (2013) đã sử dụng eCG với liều 2500 IU để đối sánh với sử dụng FSH (200 mg). Kết quả nghiên cứu cho thấy, số thể vàng và số phôi thu được ở nhóm điều trị bằng eCG ít hơn so với nhóm sử dụng FSH; tuy nhiên cao hơn so với các nghiên cứu trước đó. Nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng,
việc kết hợp siêu âm buồng trứng để xác định giai đoạn nang trứng để lựa chọn thời điểm và phương pháp xử lý tối ưu để kích thích bằng hormone nhằm thu được lượng trứng và phôi tốt nhất trong phương pháp tạo trứng, phôi in vivo.
Hiện nay, việc sản xuất eCG cho mục đích điều trị được thực hiện bằng cách thu thập máu từ ngựa cái đang mang thai, trong các trang trại chuyên biệt chủ yếu ở Argentina và Uruguay [10]. eCG được tiết vào máu từ các tế bào biểu mô nguyên bào phôi (trophoblast) ngựa từ ngày thứ 40 đến ngày thứ 130 sau khi bắt đầu mang thai. Máu được lấy từ tĩnh mạch bên ngoài và nội tiết tố được chiết xuất bằng cách kết tủa gradient etanol phân đoạn và sau đó được tách bằng sắc ký. Phương pháp này đang thu hút sự chú ý ngày nay vì nó được quản lý rất kém và gây tranh cãi về điều kiện chăn nuôi ngựa cái. Một số thực hành nhất định được đưa ra nghi vấn, chẳng hạn như lấy quá nhiều máu, hoặc kích hoạt phá thai vào cuối kỳ sản xuất để bắt đầu lại chu kỳ [10]. Tuy nhiên, cho đến nay, không có giải pháp thay thế hiệu quả nào cho việc sản xuất công nghiệp loại hormone này trong ống nghiệm.
Sản xuất in vitro liên quan đến việc tái tổ hợp di truyền của dòng tế bào được sử dụng. Sản xuất các hormone tái tổ hợp thông qua việc chuyển nạp hai plasmid, một plasmid chứa trình tự của tiểu đơn vị α và một của tiểu đơn vị β. Sự hiện diện của glycosyl hóa đòi hỏi những sửa đổi sau dịch mã, giới hạn của chúng thường được áp đặt bởi tiềm năng glycosyl hóa của các dòng tế bào được sử dụng trong sản xuất. Chỉ các tế bào nhân thực (nấm men, tế bào thực vật, tế bào côn trùng hoặc động vật có xương sống) mới có khả năng thực hiện glycosyl hóa, nhưng các tế bào đủ điều kiện nhất để sản xuất glycoprotein phức tạp là tế bào động vật có vú [11]. Cấu trúc bậc bốn của hormone glycoprotein đòi hỏi sự cân bằng tốt giữa sự biểu hiện của hai tiểu đơn vị để có được sự sản xuất tốt các chất dimer. Bằng cách hợp nhất các gen mã hóa tiểu đơn vị α và
Trong eCG sợi đơn, phần mở rộng CTP của tiểu đơn vị β đóng vai trò như một liên kết giữa các tiểu đơn vị. Vì nó có mười hai O-glycosyl hóa hầu như không cần thiết cho các hoạt động sinh học và khó thu được một cách có kiểm soát, nó có thể được thay thế bằng một trình tự cho phép đơn giản hóa các sửa đổi sau dịch mã. Trong các hormone này, sau đó không có quá trình O-glycosyl hóa nữa.
Việc tạo ra các eCG ở dạng đột biến hay tái tổ hợp đã được thực hiện để kiểm tra vai trò của các chuỗi N- saccharides và O- saccharides trong tác động đến hoạt động của các hormone LH và FSH. Hai hormone eCG đột biến là eCGα56/β và eCGα/β-CTP lần lượt được tạo ra bởi việc Asn56 của tiểu đơn vị α được thay thế bằng Gln, hoặc phần mở rộng CTP của tiểu đơn vị β bị loại bỏ. Gene đột biến được chuyển vào dòng tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary) để sản sinh ra các hormone đột biến. Kết quả cho thấy, đối với eCGα56/β, hoạt động của LH giảm mạnh, tuy nhiên điều này ở eCGα/β-CTP không bị ảnh hưởng. Điều này chứng tỏ N- saccharide ở Asn56 đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của LH. Điều thú vị là hoạt động của FSH do tác động của eCGα56/β và eCGα/β-CTP tăng lên đáng kể so với eCG tự nhiên. Các kết quả cho thấy, tác động kép của eCG đối với hoạt động của LH và FSH có thể bị tách biệt bởi việc loại bỏ liên kết N- saccharide tại Asn56 của tiểu đơn vị α hay các liên kết O- saccharides trên CTP của tiểu đơn vị β. Ở một nghiên cứu khác, eCG chuỗi đơn (tethered-eCG, T-βα) được tạo ra bởi linker là phần mở rộng CTP của tiểu đơn vị β, sau đó được gây đột biến bằng cách loại bỏ các vị trí glycosyl hóa tại Asn56 của tiểu đơn vị α hoặc/và phần mở rộng CTP của tiểu đơn vị β. Kết quả cho thấy, ở T-βα chưa bị gây đột biến, hoạt động của LH và FSH diễn ra bình thường như eCG tự nhiên. Tuy nhiên, ở T-βα bị loại bỏ liên kết N- saccharide tại Asn56 của tiểu đơn vị α, hoạt động của LH giảm, trong khi ở T-βα bị loại bỏ các liên kết O- saccharide trên CTP của tiểu đơn vị β, hoạt động của hormone
này giảm nhẹ nhưng sau đó tương tự như trường hợp của T-βα chưa bị gây đột biến. Đối với T-βα bị loại bỏ các vị trí glycosyl hóa ở cả Asn56 và phần mở rộng CTP, hoạt động của LH giảm. Trong khi đó, ở dạng T-βα chưa gây đột biến và ở tất cả các dạng đột biến, hoạt động của FSH được giữ nguyên so với eCG tự nhiên. Vì vậy, vai trò sinh học của N-saccharide ở Asn56 và O-saccharides ở CTP khác nhau trong tác động đến hoạt động của LH và FSH [12].
Để so sánh thời gian bán hủy của eCG tự nhiên (N-eCG) và eCG tái tổ hợp (R-eCG) được tạo ra bởi linker là phần mở rộng CTP của tiểu đơn vị β, một nghiên cứu đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy, eCG được phát hiện trong cả 2 nhóm (nồng độ khoảng 550 mIU/mL) trong huyết thanh vào 1 giờ sau tiêm. Tốc độ bán hủy của R-eCG cao hơn một chút tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể sau 1 giờ điều trị. Nồng độ của eCG thấp (khoảng 100 mIU/mL) sau 24 giờ. Theo kết quả nghiên cứu, R-eCG có thời gian bán hủy bình thường và có khả năng gây rụng trứng như N-eCG [13]. Việc tạo R-hCG cũng đã được tiến hành để phân tích về cấu trúc và chức năng của các hormone. Chuỗi đơn được thiết kế sao cho đầu C-termirus của tiểu đơn vị β được hợp nhất di truyền với đầu N- termirus của tiểu đơn vị α. Trình tự CTP của tiểu đơn vị β có chức năng như một linker. Chuỗi này bao gồm một vài amino acid như Proline và Serine dư nên thiếu đáng kể cấu trúc cấp hai. Điều này sẽ cho phép tiểu đơn vị α định hướng thích hợp với tiểu đơn vị β. Plasmid tái tổ hợp được cấy truyền vào dòng tế bào CHO [14].
1.4. Tế bào HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293)