5. Những đóng góp mới của đề tài
2.4.2. Theo dõi và cấy truyền tế bào
Tế bào được quan sát bằng mắt: môi trường phải duy trì màu hồng đỏ cho thấy các điều kiện tối ưu cho tế bào (pH, O2/CO2, lượng chất dinh dưỡng), và nếu nó chuyển sang màu vàng thì phải nhanh chóng thay đổi, sau đó quan sát thông qua kính hiển vi, khi các tế bào chiếm 90% và 100% diện tích hộp nuôi cấy, chúng phải được cấy vào các bình mới.
Để làm được điều này, môi trường nuôi cấy phải được lấy ra khỏi bình và các tế bào phải được tráng với 1mL PBS (Phosphate Buffered Saline) để loại bỏ phần còn lại của các protein kháng trypsin. Tiếp theo, 1ml trypsin 0,05% (w/v) được thêm vào, sau đó các bình được ủ trong 5 phút ở 37°C, nơi hoạt
động của peptidase của nó là tối ưu. Khi các tế bào đã tách ra khỏi thành, phản ứng dừng lại với việc bổ sung 5ml môi trường EMEM cho HEK 293 để ngăn chặn sự suy thoái quá, có hại cho tế bào. Phản ứng dừng lại khi có thêm protein thông qua SVF chứa trong môi trường. Từ huyền phù tế bào thu được, thể tích tế bào mong muốn được đưa vào một bình nuôi cấy 25 cm² mới, được thêm đến 9mL với môi trường tương ứng. Đối với các mặt bích lớn 75 cm², thể tích được tăng gấp đôi. Các bình sau đó được ủ trong tủ sấy ở 37°C. trong môi trường ẩm với 5% CO2.
2.4.3. Phương pháp tính tỷ lệ sống của tế bào
Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào phải được đếm để biết số lượng tế bào sống để sản xuất eCG. Huyền phù tế bào được nhuộm với dung dịch thuốc nhuộm Trypan blue theo tỷ lệ 1:1 về thể tích.
Đầu tiên hút 10 µl huyền phù tế bào cho vào ống eppendorf 1,5ml, thêm vào 90 µl dung dịch PBS và dùng micropipet trộn đều. Hút 10 µl huyền phù tế bào vừa pha loãng cho vào 1 ống eppendorf mới, sau đó thêm vào 10 µl dung dịch Trypan blue và dùng micropipet trộn đều. Hút 10 µl dung dịch tế bào đã nhuộm với Trypan blue tra vào buồng đếm tế bào Thoma. Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10X (tương đương độ phóng đại 100x), đếm tế bào theo hình zizac từ trái qua phải, từ trên xuống dưới, đếm tất cả tế bào nằm trong 16 ô đếm, những tế bào nằm cạnh ngoài của 16 ô chỉ đếm tế bào ở cạnh trên và cạnh trái (và những tế bào nào nằm phía trong ít nhất 1/2).
Khi quan sát và đếm tế bào dưới kính hiển vi, những tế bào sống sẽ không bắt màu với thuốc nhuộm, còn những tế bào đã chết sẽ bắt màu xanh của thuốc nhuộm. Sau khi đã xác định được số lượng tế bào sống (SLTBS) và tế bào chết (SLTBC) trong các ô của buồng đếm tế bào Thoma, áp dụng công thức sau để xác định số lượng tế bào sống trong 1ml.
Tế bào sống được đến trên Buồng đếm tế bào Thoma và được biểu thị bằng ô/ml theo công thức sau:
SLTBS (tế bào/ml) = N1 x A x 2 x 104
Trong đó: N1 là số lượng trung bình của tế bào sống A là hệ số pha loãng
SLTBC (tế bào/ml) = N2 x A x 2 x 104
Trong đó: N2 là số lượng trung bình của tế bào chết A là hệ số pha loãng
Tỷ lệ sống của tế bào:
TLS (%) = 𝐒𝐋𝐓𝐁𝐒
(𝐒𝐋𝐓𝐁𝐒+𝐒𝐋𝐓𝐁𝐂)