5. Những đóng góp mới của đề tài
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả được biểu diễn dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng phần mềm GRAPHPAD PRISM (test thống kê Anova) để so sánh sự khác biệt giữa các thí nghiệm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0.05.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tỷ lệ sống của tế bào HEK sau khi rã đông từ -196°C
Tế bào HEK 293 vừa được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C) sẽ co cụm và có hình dạng hình tròn vì đang trong trạng thái ngủ đông (Hình 3.1), sau thời gian ủ 48 giờ tế bào sẽ phát triển thành hình dạng ban đầu gần giống dạng hình thoi kéo dài hai đầu.
(a) (b)
Hình 3.1. Tế bào HEK 293 nuôi cấy sau khi rã đông
(a)- độ phóng đại 100X; (b) - độ phóng đại 630X
(a) (b)
Hình 3.2. Tế bào HEK 293 sau 48 giờ nuôi cấy
Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào HEK 293 đã trở về hình dạng bình thường như trước khi trữ đông (Hình 3.2). Mật độ tế bào trên bề mặt của hộp nuôi cấy chiếm khoảng 40% diện tích bề mặt.
Khi quan sát hộp nuôi cấy bằng mắt thường, chúng ta có thể thấy màu của môi trường nuôi cấy (màu đỏ) đã nhạt màu hơn so với ngày đầu tiên nuôi cấy (chuyển sang màu đỏ cam). Tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 thêm 24 giờ rồi sau đó tiến hành thay môi trường lần thứ nhất, lúc này môi trường đã chuyển sang màu vàng.
Việc thay môi trường nuôi cấy có ý nghĩa giúp loại bỏ môi trường cũ (môi trường đã sắp hết chất dinh dưỡng) và bổ sung môi trường mới nhằm cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho tế bào sinh trưởng và phát triển ổn định. Đồng thời giúp loại bỏ chất thải của tế bào qua quá trình trao đổi chất để sinh trưởng phát triển, loại bỏ tế bào chết. Nếu để cho các tác nhân này tồn tại quá lâu trong hộp nuôi cấy thì chúng có thể là những tác nhân gây nhiễm khuẩn hộp tế bào đang được nuôi cấy và làm tế bào chết (Hình 3.3).
Sau 72 giờ nuôi cấy (Hình 3.4), tiến hành thay môi trường nuôi cấy lần thứ nhất. Mặc dù tế bào HEK 293 là tế bào bám dính, tuy nhiên độ bám dính của chúng trên bề mặt hộp nuôi cấy không cao, cho nên khi thao tác cần thực hiện cẩn thận và từ từ, tránh hút hoặc đẩy dung dịch quá mạnh sẽ làm bong tróc tế bào khỏi bề mặt hộp nuôi cấy và có thể gây chết tế bào.
Sử dụng Pasteur pipette 10ml hút bỏ môi trường cũ, sau đó bổ sung thêm 5ml môi trường nuôi cấy mới vào hộp và tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2.
(a) (b)
Hình 3.4. Tế bào HEK 239 sau 72 giờ nuôi cấy
(a) – độ phóng đại 100X; (b) – độ phóng đại 400X
Tiếp tục nuôi tế bào trong 24 giờ, lúc này mật độ tế bào trong hộp nuôi cấy đã chiếm khoảng 60 – 70% diện tích bề mặt. Tiến hành cấy truyền lần thứ nhất, đầu tiên sử dụng Pasteur pipette 10ml hút bỏ môi trường dinh dưỡng cũ, rửa lại hộp nuôi cấy 3 lần bằng dung dịch muối PBS, việc rửa lại hộp nuôi cấy bằng PBS sẽ giúp loại bỏ hết protein còn sót lại của môi trường nuôi cấy cũ, vì protein sẽ làm bất hoạt Trypsin. Sau đó, nhỏ 1ml dung dịch Trypsin 0,05% (w/v), đưa vào tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 đợi trong vòng 5 phút. Khi các tế bào đã bong khỏi bề mặt của hộp nuôi cấy và tách riêng lẻ thành từng tế bào riêng lẻ hoặc cụm 2 – 3 tế bào là được. Dùng Micropipette hút 1ml huyền phù tế bào
cho vào hộp nuôi cấy mới, sau đó bổ sung thêm 5ml dung dịch môi trường nuôi cấy rồi tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2.
Hình 3.5. Tế bào HEK 293 sau khi được tách bằng dung dịch Trypsin 0,05% (w/v)
Để đảm bảo chất lượng tế bào HEK 293 sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo chúng ta cần xác định mật độ tế bào và tỷ lệ sống của tế bào qua các lần cấy truyền.
Sau 48 giờ kể từ lần cấy truyền thứ nhất, mật độ tế bào quan sát dưới kính hiển vi đã đạt 80 – 90% diện tích bề mặt, chúng ta sẽ tiếp hành cấy truyền thêm ra các hộp nuôi cấy mới và xác định tỷ lệ sống của tế bào (Bảng 3.1). Nếu tỷ lệ sống của tế bào ổn định qua nhiều lần cấy truyền cho chúng ta biết dòng tế bào đã ổn định về hoạt tính sinh học sau quá trình bảo quản đông lạnh và rã đông, chúng ta có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Số lượng tế bào và tỷ lệ sống của tế bào Số lần cấy truyền SLTBS (tế bào/ml) SLTBC (tế bào/ml) TLS (%) Lần 1 (12 ± 3,162) x 10 5 tế bào/ml 0 100 Lần 2 (9 ± 4,761) x 10 5 tế bào/ml 0 100 Lần 3 (11 ± 1,633) x 10 5 tế bào/ml 0 100
Hình 3.6. Tế bào HEK 293 sau 6 ngày nuôi cấy (độ phóng đại 100X) 3.2. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường có bổ sung protein.
Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là để xác minh việc sản xuất eCG tái tổ hợp được sản xuất ra từ dòng tế bào HEK 293. Các tế bào được truyền đồng
nhất với 2 μg DNA và tỷ lệ DNA (μg) / chất truyền (μl) là 1: 2 (tức là 4 µl chất truyền nhiễm). eCG tái tổ hợp kiểu số tự nhiên (eCG NZY 01) được sử dụng như một đối chứng. Đối với điều này, các tế bào HEK 293 được đồng chuyển gen với α và β kiểu hoang dại với cùng một vectơ biểu hiện như eCG sợi đơn (1 μg DNA cho mỗi tiểu đơn vị). Một điều kiện khác là chuyển nạp GFP (Protein phát huỳnh quang màu xanh) với cùng một vectơ biểu hiện, như một sự kiểm soát trực quan của quá trình chuyển nạp (đối chứng âm).
Trong kỹ thuật tạo protein tái tổ hợp eCG thì chất lượng của protein tái tổ hợp phụ vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, tốc độ lắc/khuấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian thu mẫu sau cảm ứng, OD, lượng chất feed-back, pH, các thành phần môi trường, chất lượng tế bào, tách chiết và tinh sạch DNA gene cần tạo dòng, gene mã hóa cho protein mong muốn, vector chuyển gene, kỹ thuật chuyển gene mong muốn vào tế bào nhận, tỷ lệ DNA/chất chuyển nạp…. và một yếu tố rất quan trọng quyết định chất lượng hormone eCG tái tổ hợp đó là hiệu suất của protein hoặc nồng độ của sản phẩm được tích lũy trong sinh khối. Do đó, chúng tôi đã chú ý cải thiện sự biểu hiện gen biến nạp trong cây chuyển gen thông qua việc phát triển các promoter tốt hơn, chọn lọc các dòng chuyển gen ổn định, và ức chế gen im lặng (silence gene).
Các điều kiện tối ưu để chuyển nạp gen vào tế bào HEK 293 vẫn không cho phép thu được đủ thể tích hormone eCG cho thí nghiệm in vivo. Do đó, để tập trung eCG do các tế bào tiết ra, chúng tôi dự tính làm đông khô các chất nổi phía trên. Để hòa tan sản phẩm trong một môi trường đệm tối thiểu, cần phải vượt qua lượng lớn protein ngoại bào được cung cấp từ BSA (môi trường A) hoặc FBS (môi trường B) trong quá trình sản xuất. Trước đó, điều bắt buộc là phải đảm bảo sản xuất tốt trong môi trường không có protein. Do đó, các tế bào được chuyển đồng nhất với 2 µg DNA và tỷ lệ DNA/môi trường chuyển nạp là
Đầu tiên, các tế bào HEK 293 được truyền nạp trong môi trường B có bổ sung protein FBS trong ba giếng trên một đĩa 6 giếng, để đảm bảo độ bám dính của chúng với các giếng và sự nhân lên của chúng. Sau 48 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát bằng kính hiển vi trạng thái tế bào sau khi chuyển nạp (Ký hiệu D2 cho 48 giờ nuôi cấy sau khi chuyển nạp), sau đó môi trường từ ba giếng này được loại bỏ hoàn toàn và thay thế bằng một môi trường khác cho mỗi giếng. eCG trong phần nổi trong ba giếng được thu hồi trên D2 và được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA “sandwich” (Hình 3.7).
Hình 3.7. Nồng độ eCG được sản xuất ra từ tế bào HEK 293 trong môi trường sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường có bổ sung FBS
Đồ thị trên thể hiện đường cong độ hấp thụ đọc ở bước sóng 450nm. Màu xanh thể hiện nồng độ của dải eCG NZY-01 (đối chứng) và các màu còn lại thể hiện nồng độ của eCG được tiết ra từ HEK 293 tại các giếng sau 48 giờ.
Trong thí nghiệm này, ở mẫu đối chứng, nồng độ của eCG NZY01 sử dụng trong xét nghiệm ELISA “sandwich” càng cao thì cường độ tín hiệu huỳnh quang càng cao. Tương tự như vậy, tại các giếng thí nghiệm 1, 2, 3,
chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Khi sử dụng thể tích phần nổi thu được từ các giếng càng nhiều thì tín hiệu thu được tại bước sóng 450nm càng cao. Điều này cho thấy rằng sau 48 giờ cấy truyền DNA thì dòng tế bào HEK 293 đã bắt đầu tiết ra hormone eCG.
Để khẳng định kỹ thuật chuyển nạp DNA plasmid thành công, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào sau 48 giờ chuyển nạp. Kết quả trình bày ở bảng 3.2 cho thấy rằng chuyển nạp 2 µg DNA và tỷ lệ DNA/môi trường chuyển nạp là 1: 2 đã không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tế bào. Như vậy kết quả tín hiệu huỳnh quang thu được từ các giếng trong hình 3.7 là hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ eCG mà tế bào đã tiết ra sau 48 giờ nuôi cấy. Ngoài ra, trong thử nghiệm ELISA, phần nổi trên từ ba giếng chứa gần như cùng một lượng eCG, được định lượng ở 150 ng/ml cho giếng 1; 135 ng/ml đối với giếng 2 và 110 ng/ml đối với giếng 3, định lượng này tính được dựa trên nồng độ chuẩn của eCG NZY-01.
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống của tế bào HEK 293 sau 48 giờ chuyển nạp Mẫu 0 giờ nuôi cấy sau 48 giờ chuyển nạp (%)
eCG NZY 01 100% 98,61 ± 0,14 Giếng 1 99,72 ± 0,05 Giếng 2 97,55 ± 0,11 Giếng 3 99,61 ± 0,09 GFP 1:4 99,47 ± 0,05
Trong quá trình sản xuất chúng tôi thấy rằng, để sản xuất eCG trong môi trường không có protein huyết thanh, sự thay đổi môi trường của các tế bào HEK 293 đã được chuyển nạp phải diễn ra khi các tế bào được kết dính chính xác và tỷ lệ dính bám chiếm diện tích ít nhất là 60%, tức là tối thiểu phải sau 48 tiếng từ khi chuyển nạp DNA thành công. Khi quan sát sản xuất sau 2 ngày
nuôi cấy, lượng eCG cuối cùng là không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê tại các giếng. Điều này cho thấy rằng quá trình chuyển nạp và nuôi cấy tế bào HEK 293 là đồng nhất, lượng hormone eCG thu được tại các giếng là tương đương nhau. Do vậy, chúng tôi tiếp thực hiện thí nghiệm thứ hai với đề xuất thay môi trường FBS bằng môi trường ít protein hơn để có thể đông khô và cô đặc eCG tạo ra nhiều nhất có thể.
3.3. Khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường không có bổ sung protein. trường không có bổ sung protein.
Như vậy chúng tôi đã thành công trong việc cấy truyền DNA tái tổ hợp có trình tự phù hợp với trình tự của eCG tự nhiên vào dòng tế bào HEK 293. Tuy nhiên để thu được chất lượng eCG tốt nhất và thể tích eCG tiết ra nhiều hơn thì chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm tiếp theo trong môi trường không bổ sung protein FBS và BSA.
Tiếp theo thí nghiệm ở phần 3.2 sau khi thu phần dịch nổi để kiểm tra bằng ELISA “sandwich” thì giếng thứ nhất được thay vào môi trường B (bổ sung FBS), giếng thứ hai chứa môi trường A (bổ sung BSA) và giếng thứ ba không bổ sung thêm protein trong quá trình chuẩn bị (môi trường C) rồi tiếp tục nuôi cấy thêm 2 ngày nuôi. Sau đó các chất nổi phía trên được lấy ra và việc sản xuất bị dừng lại (ký hiệu là D4 cho 4 ngày nuôi cấy). Chất nổi sau đó được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA “sandwich”. Kết quả của chúng tôi được trình bày trong hình 3.8.
Hình 3.8. Nồng độ eCG được sản xuất ra từ tế bào HEK 293 trong môi trường sau 4 ngày nuôi cấy trong vào môi trường B (bổ sung FBS), môi trường A (bổ sung BSA) và
môi trường C (không bổ sung thêm protein BSA).
Đồ thị trên thể hiện đường cong độ hấp thụ đọc ở bước sóng 450nm. Màu xanh thể hiện nồng độ của dải eCG NZY-01 (đối chứng) và các màu còn lại thể hiện nồng độ của eCG được tiết ra từ HEK 293 tại các giếng sau 4 ngày nuôi cấy.
Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sản xuất eCG từ trong môi trường B có bổ sung protein FBS (giếng 1) thì sau 4 ngày nuôi cấy thu được lượng eCG là thấp nhất với 355 ng/ml thấp nhất, cao hơn là trong môi trường A có bổ sung protein BSA (giếng 2) với 405 ng/ml và cao nhất là trong môi trường C không bổ sung protein (giếng 3) với 510 ng/ml.
Đồ thị 3.8 cũng thể hiện một kết quả tương tự khi cho thấy biểu hiện tín hiệu huỳnh quang của eCG tại giếng 3 là cao hơn giếng 1 và 2. Tuy nhiên sự gia tăng này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Phần nổi phía trên của các tế bào HEK 293 được truyền để thể hiện GFP thu được trong thao tác trước đó
được sử dụng làm đối chứng âm tính (tỷ lệ 1: 4) không thu được tín hiệu huỳnh quang.
Các thử nghiệm khác nhau từ phần nổi thu được trên D2 cho thấy tín hiệu ở các giếng với môi trường B có bổ sung protein FBS là giống nhau. Điều này cho thấy sản xuất eCG giống hệt nhau ở tất cả các giếng, đảm bảo rằng không có sự sai lệch trước sự thay đổi đối với các môi trường khác nhau trong thí nghiệm tiếp theo. Trên D4, lượng eCG trong dịch nổi tế bào HEK 293 ở môi trường có FBS và môi trường có BSA là tương tự nhau. Lượng hormone cao nhất được quan sát thấy trong phần nổi của tế bào HEK 293 sản xuất trong môi trường không có FBS và không có BSA. Tuy nhiên, các đại lượng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Do đó, có thể sản xuất eCG trong môi trường không có FBS và không có BSA từ ngày sản xuất thứ hai mà không ảnh hưởng đến lượng hormone cuối cùng được tiết ra trong môi trường. Điều này giúp cho quá trình đông lạnh hormone để cô đặc nhằm thanh lọc tốt hơn và sau đó giải phóng hormone cho thí nghiệm in vivo (hạn chế thể tích tiêm).
3.4. Xác định đặc tính sinh học của eCG tái tổ hợp thông qua nồng độ cAMP nội bào. cAMP nội bào.
Một trong những tiêu chí đánh giá sự thành công trong quá trình sản xuất hormone eCG tái tổ hợp là phải đảm bảo được hoạt tính sinh học của nó sau khi sản xuất. Do vậy chúng tôi đã tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học của eCG tiết ra trong môi trường nuôi cấy tế bào HEK 293 thông qua tín hiệu cAMP sau khi sử dụng eCG này kích thích tế bào mLTC-1.
cAMP là một chất truyền tin thứ hai quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, là một dẫn xuất của ATP và được sử dụng để truyền tín hiệu nội bào ở nhiều sinh vật khác nhau, truyền tin theo con đường phụ thuộc vào cAMP. Nhiều hormone tác động đến tế bào đích của chúng thông qua các thụ thể trên
màng tế bào và dẫn đến quá trình hình thành cAMP. Sau khi được tổng hợp, cAMP sẽ tác động đến nhiều hoạt động sinh lý bên trong tế bào thông qua protein kinase A. cAMP sẽ đóng vai trò là chất truyền thông tin thứ hai cho các tác động của hormone.
Trong thí nghiệm này, để xác định hoạt tính sinh học của eCG trong phần nổi thu được sau nuôi cấy tại D4 có ảnh hưởng đến sự tổng hợp cAMP hay không. Tế bào mLTC-1 được nuôi cấy 48 tiếng trong môi trường RPMI, sau đó kích thích tế bào bằng dịch nổi thu được tại D4 với có hiện diện của eCG ở các nồng độ khác nhau (0,25, 0,5 và 1 µl/giếng). Nồng độ cAMP nội bào được đo thông qua sự phát quang oxiluciferin được tạo ra từ quá trình oxy hóa luciferin trong 60 phút, những giá trị này sau đó được chuyển đổi thành động lực tác động của khu vực dưới đường cong (AUC). Kết quả được thể hiện ở hình 3.9.