5. Những đóng góp mới của đề tài
2.4.6. Phương pháp xét nghiệm ELISA “Sandwich”
Đối với ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) của eCG có trong phần nổi thu được, một đĩa MAXISORB 96 giếng (NUNC, Dutscher) được sử dụng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp thụ của protein trên nhựa. Đáy giếng được phủ một kháng thể đa dòng α-eCG 89A2 được pha loãng thành 1/50.000 trong 0,1M natri cacbonat/bicacbonat và ủ qua đêm ở 4°C. Sau đó, đĩa được rửa 3 lần bằng đệm rửa PBS_Tween_20 ở 1‰ để loại bỏ những kháng thể không gắn và được làm khô bằng cách đảo ngược. Các vị trí không đặc hiệu bị khóa lại bằng PBS bổ sung 0,2% albumin huyết thanh bò. Sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, đĩa được rửa lại như đã trình bày trước đó.
NZY-01 eCG được sử dụng làm phạm vi tham chiếu cho xét nghiệm. Nó được pha loãng trong dung dịch đệm xét nghiệm đến các nồng độ mong muốn: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16… Phần nổi thu được sau nuôi cấy có chứa eCG cũng sẽ được pha loãng ở nồng độ tương tự như nồng độ của tham chiếu. Các mẫu khác nhau được thử nghiệm lặp lại và ủ ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đĩa sau đó lại được rửa 3 lần bằng đệm rửa PBS_Tween_20 ở 1‰ để loại bỏ kháng nguyên không gắn và kháng thể đa dòng đặc hiệu eCG được pha loãng 1/20.000 được thêm vào và tiếp tục ủ trong 1 giờ. Sau đó, đĩa được rửa lại một lần nữa và một kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG (Immunoglobulin G) được liên hợp với HRP được pha loãng đến 1/40.000 được thêm vào đó. Đĩa được ủ trong thêm ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đĩa được rửa sạch và sau đó bổ sung 100 μl/giếng TMB, là chất nền cho HRP. Sau đó ủ đĩa trong bóng tối 20 phút vì chất nền là chất cảm quang. Phản ứng dừng lại bằng cách thêm 50µl/ giếng axit H2SO4 2N. Việc đọc độ hấp thụ được thực hiện bởi một đầu đọc đĩa ở bước sóng 450nm.