Ứng dụng của HEK293

5. Những đóng góp mới của đề tài

1.4.2. Ứng dụng của HEK293

Tế bào HEK 293 dễ dàng phát triển trong môi trường nuôi cấy và lây nhiễm. Chúng đã được sử dụng làm vật chủ để biểu hiện gen. Thông thường, các thí nghiệm này liên quan đến việc chuyển gen (hoặc tổ hợp gen) quan tâm, và sau đó phân tích protein biểu hiện. Việc sử dụng rộng rãi dòng tế bào này là do khả năng lây nhiễm của nó bằng các kỹ thuật khác nhau, bao gồm cả phương pháp canxi photphat, đạt được hiệu quả gần 100%.

Tế bào HEK 293 đã được thích nghi để phát triển trong môi trường nuôi cấy huyền phù, trái ngược với sự tăng sinh trên đĩa nhựa, vào năm 1985. Điều này cho phép sự phát triển của một lượng lớn vectơ adenovirus tái tổ hợp.

Hình 1.5. Miễn dịch huỳnh quang tế bào HEK 293

Một cách sử dụng cụ thể hơn của các tế bào HEK 293 là trong việc truyền các vectơ adenoviral [48]. Virus cung cấp một phương tiện hiệu quả để đưa các gene vào tế bào, mà chúng đã tiến hóa để thực hiện, và do đó được sử dụng nhiều làm công cụ thí nghiệm. Tuy nhiên, là mầm bệnh, chúng cũng có nguy cơ đối với người thử nghiệm. Mối nguy hiểm này có thể tránh được bằng cách sử dụng các virus thiếu các gene quan trọng và do đó không thể tái tạo sau khi xâm nhập vào tế bào. Để nhân giống các vectơ virus như vậy, cần phải có một dòng tế bào biểu hiện các gene bị thiếu. Vì các tế bào HEK 293 biểu hiện một số gene adenoviral, chúng có thể được sử dụng để nhân giống các vectơ adenoviral trong đó các gene này (điển hình là E1 và E3) bị xóa, chẳng hạn như AdEasy. Tuy nhiên, sự tái tổ hợp tương đồng giữa trình tự Ad5 trong tế bào được chèn vào và trình tự vectơ, mặc dù rất hiếm, có thể khôi phục khả năng sao chép cho vectơ [49].

Một biến thể quan trọng của dòng tế bào này là dòng tế bào 293T. Nó chứa kháng nguyên T lớn SV40 cho phép sao chép từng đợt của các plasmid đã được truyền nhiễm có chứa nguồn gốc sao chép SV40. Điều này cho phép khuếch đại các plasmid đã truyền và kéo dài thời gian biểu hiện của các sản phẩm gene mong muốn. HEK 293, và đặc biệt là HEK 293T, các tế bào thường được sử dụng để sản xuất các vectơ retrovirus khác nhau. Các dòng tế bào đóng gói retrovirus khác nhau cũng dựa trên các tế bào này [48].

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng nghiên cứu

Khả năng sản xuất gonadotropin màng đệm ngựa (equine chorionic gonadotropin) chuỗi đơn của dòng tế bào HEK 293.

2.2. Hóa chất và thiết bị

Thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Trung nghiên cứu động vât thực nghiệm, Học viện Quân Y Hà Nội.

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ Sigma Aldrich (Trung Quốc) trừ khi có ghi chú khác. pGlosensorTM-22F plasmid và CellTiter-Blue Cell (G8080) từ Promega (Pháp), X-tremeGENETM-HP-DNA đến từ Roche (Pháp). Môi trường EMEM, FBS, QUALIFIED 500ml, Trypsin- EDTA (0,05%), phenol red, Geneticin 20ml, DPBS 10X1L, HEPES, Hygromycin B từ Merk (Đức).

Các thiết bị chính sử dụng trong thao tác thực hiện thí nghiệm: Bể ổn nhiệt, máy khuấy trộn, lò vi sóng, máy ly tâm Eppendorf - Centrifuge 5424R, tủ an toàn sinh học ESCO class II,cân phân tích (Metter Toledo), máy lắc (IKA), máy ly tâm (Biofuge Fresco Heraeus), catsette 18 x 24, tủ lạnh 4°C (Toshiba), tủ lạnh -80°C (Sanyo), tủ pha hóa chất, máy hút hóa chất lỏng, máy đo huỳnh quang, máy đo quang phổ Spectra Gemini, máy đọc ELISA, kính hiển vi huỳnh quang, tủ ấm, tủ nuôi cấy tế bào.

Dụng cụ : Micropipette các loại, đầu tips các loại, pipette tiệt trùng, hộp nhựa 25 cm2 nuôi cấy tế bào động vật, ống fancol 15ml, 50ml, đĩa MAXISORB 96 giếng.

2.3. Nội dung nghiên cứu

 Đánh giá khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường có bổ sung protein.

 Đánh giá khả năng sản xuất eCG tái tổ hợp của tế bào HEK 293 trong môi trường không có bổ sung protein.

 Xác định đặc tính sinh học của eCG tái tổ hợp thông qua nồng độ cAMP nội bào.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Nuôi cấy tế bào

Tế bào HEK 293 nuôi cấy sau khi được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C) sẽ được nuôi cấy trong hộp nhựa 25 cm2 trong môi trường EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) có bổ sung huyết thanh bò 1 tuần trước khi cấy truyền vào các giếng trên một đĩa nuôi cấy 96 lỗ, sau đó mang ủ ở 37°C với 5% CO2 trong vòng 48 tiếng. Trong quá trình nuôi cấy lần một trong hộp nhựa, chúng ta cần thay môi trường sau 3 ngày và trong lần cấy truyền lần hai trong đĩa 96 lỗ thì thay môi trường sau 24 giờ nuôi cấy.

2.4.2. Theo dõi và cấy truyền tế bào

Tế bào được quan sát bằng mắt: môi trường phải duy trì màu hồng đỏ cho thấy các điều kiện tối ưu cho tế bào (pH, O2/CO2, lượng chất dinh dưỡng), và nếu nó chuyển sang màu vàng thì phải nhanh chóng thay đổi, sau đó quan sát thông qua kính hiển vi, khi các tế bào chiếm 90% và 100% diện tích hộp nuôi cấy, chúng phải được cấy vào các bình mới.

Để làm được điều này, môi trường nuôi cấy phải được lấy ra khỏi bình và các tế bào phải được tráng với 1mL PBS (Phosphate Buffered Saline) để loại bỏ phần còn lại của các protein kháng trypsin. Tiếp theo, 1ml trypsin 0,05% (w/v) được thêm vào, sau đó các bình được ủ trong 5 phút ở 37°C, nơi hoạt

động của peptidase của nó là tối ưu. Khi các tế bào đã tách ra khỏi thành, phản ứng dừng lại với việc bổ sung 5ml môi trường EMEM cho HEK 293 để ngăn chặn sự suy thoái quá, có hại cho tế bào. Phản ứng dừng lại khi có thêm protein thông qua SVF chứa trong môi trường. Từ huyền phù tế bào thu được, thể tích tế bào mong muốn được đưa vào một bình nuôi cấy 25 cm² mới, được thêm đến 9mL với môi trường tương ứng. Đối với các mặt bích lớn 75 cm², thể tích được tăng gấp đôi. Các bình sau đó được ủ trong tủ sấy ở 37°C. trong môi trường ẩm với 5% CO2.

2.4.3. Phương pháp tính tỷ lệ sống của tế bào

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào phải được đếm để biết số lượng tế bào sống để sản xuất eCG. Huyền phù tế bào được nhuộm với dung dịch thuốc nhuộm Trypan blue theo tỷ lệ 1:1 về thể tích.

Đầu tiên hút 10 µl huyền phù tế bào cho vào ống eppendorf 1,5ml, thêm vào 90 µl dung dịch PBS và dùng micropipet trộn đều. Hút 10 µl huyền phù tế bào vừa pha loãng cho vào 1 ống eppendorf mới, sau đó thêm vào 10 µl dung dịch Trypan blue và dùng micropipet trộn đều. Hút 10 µl dung dịch tế bào đã nhuộm với Trypan blue tra vào buồng đếm tế bào Thoma. Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10X (tương đương độ phóng đại 100x), đếm tế bào theo hình zizac từ trái qua phải, từ trên xuống dưới, đếm tất cả tế bào nằm trong 16 ô đếm, những tế bào nằm cạnh ngoài của 16 ô chỉ đếm tế bào ở cạnh trên và cạnh trái (và những tế bào nào nằm phía trong ít nhất 1/2).

Khi quan sát và đếm tế bào dưới kính hiển vi, những tế bào sống sẽ không bắt màu với thuốc nhuộm, còn những tế bào đã chết sẽ bắt màu xanh của thuốc nhuộm. Sau khi đã xác định được số lượng tế bào sống (SLTBS) và tế bào chết (SLTBC) trong các ô của buồng đếm tế bào Thoma, áp dụng công thức sau để xác định số lượng tế bào sống trong 1ml.

Tế bào sống được đến trên Buồng đếm tế bào Thoma và được biểu thị bằng ô/ml theo công thức sau:

SLTBS (tế bào/ml) = N1 x A x 2 x 104

Trong đó: N1 là số lượng trung bình của tế bào sống A là hệ số pha loãng

SLTBC (tế bào/ml) = N2 x A x 2 x 104

Trong đó: N2 là số lượng trung bình của tế bào chết A là hệ số pha loãng

Tỷ lệ sống của tế bào:

TLS (%) = 𝐒𝐋𝐓𝐁𝐒

(𝐒𝐋𝐓𝐁𝐒+𝐒𝐋𝐓𝐁𝐂)

2.4.4. Phương pháp chuyển nạp gen vào tế bào HEK 293

Ngay sau khi các tế bào HEK 293 được phân phối vào đĩa nuôi cấy 96 giếng tại vị trí 6 giếng đã đánh dấu, chúng ngay lập tức được chuyển nạp gen theo các điều kiện mong muốn. Một hỗn hợp chuyển gen của mỗi điều kiện nên được chuẩn bị 20 phút trước khi truyền. Hỗn hợp này bao gồm 200 μL môi trường EMEM không có huyết thanh SVF, một lượng DNA plasmid mong muốn (eCGs hoặc GFP (Green Fluorescent Protein) để kiểm soát tích cực sự chuyển nạp) theo các điều kiện chuyển nạp (theo thứ tự của µg). Cũng như một thể tích chất chuyển gen Xtreme (Sigma-Aldrich, Pháp) tỷ lệ với số lượng DNA plasmid (theo thứ tự µL).

Sau 20 phút, thời gian hình thành phức hợp DNA/chất truyền nhiễm, hỗn hợp trên được phân phối vào 6 giếng chứa các tế bào HEK 293. Sau đó, các tế bào này được ủ ở 37°C trong môi trường ẩm với 5% CO2 trong một khoảng thời gian thay đổi tùy theo nhu cầu của thí nghiệm.

2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ cAMP

Tế bào HEK 293 được transfected với Glosensor-TM-22F cyclic AMP plasmid, sử dụng chất vận chuyển X-treme GENETM-HP-DNA. Plasmid này bao gồm trình tự gen mã hóa luciferase của đom đóm dung hợp với vùng liên kết cAMP của gen mã hóa protein kinase A cho phép kiểm soát hoạt động enzyme bằng cAMP. Các phiến sau đó được ủ qua đêm ở 37°C dưới 5% CO2 trước khi sử dụng các tế bào trong các xét nghiệm.

Sau đó dịch môi trường transfection được loại bỏ và thay thế bằng môi trường EMEM không có huyết thanh SVF và chứa cơ chất của luciferase là luciferin có bổ sung IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). Tế bào sau đó được ủ ở 28°C 2 giờ. Cuối cùng, kích thích bằng eCG bằng cách bổ sung vào trong giếng trước khi quan sát nồng độ cAMP bằng máy đo quang phổ huỳnh quang.

2.4.6. Phương pháp xét nghiệm ELISA “Sandwich”

Đối với ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) của eCG có trong phần nổi thu được, một đĩa MAXISORB 96 giếng (NUNC, Dutscher) được sử dụng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp thụ của protein trên nhựa. Đáy giếng được phủ một kháng thể đa dòng α-eCG 89A2 được pha loãng thành 1/50.000 trong 0,1M natri cacbonat/bicacbonat và ủ qua đêm ở 4°C. Sau đó, đĩa được rửa 3 lần bằng đệm rửa PBS_Tween_20 ở 1‰ để loại bỏ những kháng thể không gắn và được làm khô bằng cách đảo ngược. Các vị trí không đặc hiệu bị khóa lại bằng PBS bổ sung 0,2% albumin huyết thanh bò. Sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, đĩa được rửa lại như đã trình bày trước đó.

NZY-01 eCG được sử dụng làm phạm vi tham chiếu cho xét nghiệm. Nó được pha loãng trong dung dịch đệm xét nghiệm đến các nồng độ mong muốn: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16… Phần nổi thu được sau nuôi cấy có chứa eCG cũng sẽ được pha loãng ở nồng độ tương tự như nồng độ của tham chiếu. Các mẫu khác nhau được thử nghiệm lặp lại và ủ ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Đĩa sau đó lại được rửa 3 lần bằng đệm rửa PBS_Tween_20 ở 1‰ để loại bỏ kháng nguyên không gắn và kháng thể đa dòng đặc hiệu eCG được pha loãng 1/20.000 được thêm vào và tiếp tục ủ trong 1 giờ. Sau đó, đĩa được rửa lại một lần nữa và một kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG (Immunoglobulin G) được liên hợp với HRP được pha loãng đến 1/40.000 được thêm vào đó. Đĩa được ủ trong thêm ít nhất 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Đĩa được rửa sạch và sau đó bổ sung 100 μl/giếng TMB, là chất nền cho HRP. Sau đó ủ đĩa trong bóng tối 20 phút vì chất nền là chất cảm quang. Phản ứng dừng lại bằng cách thêm 50µl/ giếng axit H2SO4 2N. Việc đọc độ hấp thụ được thực hiện bởi một đầu đọc đĩa ở bước sóng 450nm.

2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng phần mềm GRAPHPAD PRISM (test thống kê Anova) để so sánh sự khác biệt giữa các thí nghiệm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0.05.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tỷ lệ sống của tế bào HEK sau khi rã đông từ -196°C

Tế bào HEK 293 vừa được rã đông từ nitơ lỏng (-196°C) sẽ co cụm và có hình dạng hình tròn vì đang trong trạng thái ngủ đông (Hình 3.1), sau thời gian ủ 48 giờ tế bào sẽ phát triển thành hình dạng ban đầu gần giống dạng hình thoi kéo dài hai đầu.

(a) (b)

Hình 3.1. Tế bào HEK 293 nuôi cấy sau khi rã đông

(a)- độ phóng đại 100X; (b) - độ phóng đại 630X

(a) (b)

Hình 3.2. Tế bào HEK 293 sau 48 giờ nuôi cấy

Sau 48 giờ nuôi cấy, tế bào HEK 293 đã trở về hình dạng bình thường như trước khi trữ đông (Hình 3.2). Mật độ tế bào trên bề mặt của hộp nuôi cấy chiếm khoảng 40% diện tích bề mặt.

Khi quan sát hộp nuôi cấy bằng mắt thường, chúng ta có thể thấy màu của môi trường nuôi cấy (màu đỏ) đã nhạt màu hơn so với ngày đầu tiên nuôi cấy (chuyển sang màu đỏ cam). Tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 thêm 24 giờ rồi sau đó tiến hành thay môi trường lần thứ nhất, lúc này môi trường đã chuyển sang màu vàng.

Việc thay môi trường nuôi cấy có ý nghĩa giúp loại bỏ môi trường cũ (môi trường đã sắp hết chất dinh dưỡng) và bổ sung môi trường mới nhằm cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho tế bào sinh trưởng và phát triển ổn định. Đồng thời giúp loại bỏ chất thải của tế bào qua quá trình trao đổi chất để sinh trưởng phát triển, loại bỏ tế bào chết. Nếu để cho các tác nhân này tồn tại quá lâu trong hộp nuôi cấy thì chúng có thể là những tác nhân gây nhiễm khuẩn hộp tế bào đang được nuôi cấy và làm tế bào chết (Hình 3.3).

Sau 72 giờ nuôi cấy (Hình 3.4), tiến hành thay môi trường nuôi cấy lần thứ nhất. Mặc dù tế bào HEK 293 là tế bào bám dính, tuy nhiên độ bám dính của chúng trên bề mặt hộp nuôi cấy không cao, cho nên khi thao tác cần thực hiện cẩn thận và từ từ, tránh hút hoặc đẩy dung dịch quá mạnh sẽ làm bong tróc tế bào khỏi bề mặt hộp nuôi cấy và có thể gây chết tế bào.

Sử dụng Pasteur pipette 10ml hút bỏ môi trường cũ, sau đó bổ sung thêm 5ml môi trường nuôi cấy mới vào hộp và tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2.

(a) (b)

Hình 3.4. Tế bào HEK 239 sau 72 giờ nuôi cấy

(a) – độ phóng đại 100X; (b) – độ phóng đại 400X

Tiếp tục nuôi tế bào trong 24 giờ, lúc này mật độ tế bào trong hộp nuôi cấy đã chiếm khoảng 60 – 70% diện tích bề mặt. Tiến hành cấy truyền lần thứ nhất, đầu tiên sử dụng Pasteur pipette 10ml hút bỏ môi trường dinh dưỡng cũ, rửa lại hộp nuôi cấy 3 lần bằng dung dịch muối PBS, việc rửa lại hộp nuôi cấy bằng PBS sẽ giúp loại bỏ hết protein còn sót lại của môi trường nuôi cấy cũ, vì protein sẽ làm bất hoạt Trypsin. Sau đó, nhỏ 1ml dung dịch Trypsin 0,05% (w/v), đưa vào tủ ấm ở 37°C với 5% CO2 đợi trong vòng 5 phút. Khi các tế bào đã bong khỏi bề mặt của hộp nuôi cấy và tách riêng lẻ thành từng tế bào riêng lẻ hoặc cụm 2 – 3 tế bào là được. Dùng Micropipette hút 1ml huyền phù tế bào

cho vào hộp nuôi cấy mới, sau đó bổ sung thêm 5ml dung dịch môi trường nuôi cấy rồi tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở 37°C với 5% CO2.

Hình 3.5. Tế bào HEK 293 sau khi được tách bằng dung dịch Trypsin 0,05% (w/v)

Để đảm bảo chất lượng tế bào HEK 293 sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo chúng ta cần xác định mật độ tế bào và tỷ lệ sống của tế bào qua các lần cấy truyền.

Sau 48 giờ kể từ lần cấy truyền thứ nhất, mật độ tế bào quan sát dưới kính hiển vi đã đạt 80 – 90% diện tích bề mặt, chúng ta sẽ tiếp hành cấy truyền thêm ra các hộp nuôi cấy mới và xác định tỷ lệ sống của tế bào (Bảng 3.1). Nếu tỷ lệ sống của tế bào ổn định qua nhiều lần cấy truyền cho chúng ta biết dòng tế bào đã ổn định về hoạt tính sinh học sau quá trình bảo quản đông lạnh và rã