4. Ý nghĩa của đề tài
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu ngang mô tả
- Nghiên cứu phân tích trong phòng thí nghiệm
Mỗi điểm nghiên cứu tiến hành điều tra muỗi Anopheles trong 4 đợt: Đợt 1: Tháng 5/2016
Đợt 2: Tháng 7/2016 Đợt 3: Tháng 9/2016 Đợt 4: Tháng 11/2016
Phỏng vấn KAP một lần vào tháng 9/2016
2.4.2. Nghiên cứu về véc tơ sốt rét
2.4.2.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Nhà rẫy nằm xa khu dân cư với cấu trúc nhà rẫy đa dạng từ thô sơ đến kiên cố và nằm rãi rác ở trong rừng. Số người trong mỗi nhà rẫy thay đổi theo từng gia đình cũng như theo mùa vụ canh tác. Chọn chủ đích hai cụm nhà rẫy nằm trong vùng sốt rét lưu hành của các xã.
2.4.2.2. Kỹ thuật điều tra muỗi Anopheles
Theo quy trình Viện Sốt rét-KST-CT Trung ương (2011) và WHO (1994), có các kỹ thuật điều tra sau:
Kỹ thuật bẫy đèn CDC trong nhà và ngoài nhà rẫy ban đêm:
Đặc tính, dựa vào đặc tính nhiều loài muỗi về đêm bị thu hút bởi một số nguồn sáng khác nhau. Mục đích là cung cấp dẫn liệu về thành phần loài, một số chỉ số (mật độ, tập tính…) để xác định phân bố và đánh giá hiệu quả các biện pháp phòng chống véc tơ, đánh giá biến động theo không gian và thời gian về kích thước quần thể các loài muỗi Anopheles.
+ Bẫy đèn trong nhà rẫy ban đêm (BĐTN): Đặt 2 đèn bẫy trong nhà suốt đêm từ 18 giờ tối đến 6 giờ sáng hôm sau. Các bẫy đèn đặt ở vị trí cao 1,5m so với mặt đất sàn nhà và gần nơi người dân thường ngủ.
+ Bẫy đèn ngoài nhà nhà rẫy ban đêm (BĐNN): Đặt 2 bẫy đèn ngoài nhà dân suốt từ 18 giờ tối đến 6 giờ sáng hôm sau. Các bẫy đèn đặt ở vị trí cao 1,5m so với mặt đất, treo bẫy đèn ở các cành cây hoặc những giá thể quanh nhà, nơi kín gió và tránh xa chuồng gia súc.
Cách tiến hành treo bẫy: bẫy được đánh dấu rõ ràng khi treo từng hộ gia đình để không bị nhầm lẫn với những hộ khác kể cả bẫy (trong và ngoài nhà rẫy), bẫy đèn được treo cách xa các nguồn ánh sáng khác, tốt nhất là không bị các ánh sáng khác làm ảnh hưởng trong thời gian treo bẫy. Bẫy được treo cách mặt đất hoặc mặt sàn khoảng 1,5 m cách vị trí ngủ khoảng 0,5 m. Lắp nguồn điện pin cho bẫy chạy thời gian bắt đầu từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau. Đến 6 giờ sáng hôm sau tiến hành thu bẫy để thu thập muỗi. Cần ghi lại đầy đủ các thông tin nhà được đặt bẫy.
Kỹ thuật mồi người trong và ngoài nhà rẫy:
Mục đích, nhằm xác định thành phần loài, mật độ, tập tính, Anopheles đốt người tại địa điểm nghiên cứu suốt đêm và mùa phát triển của muỗi trong năm.
+ Mồi người trong nhà rẫy ban đêm (MNTN): thời gian tiến hành mồi bắt đầu từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau (thời gian mồi bắt muỗi trong 1 tiếng thì mồi liên tục 45 phút sau đó nghĩ giải lao 15 phút và hết thời gian nghỉ thì tiếp tục mồi bắt muỗi lại giờ tiếp theo và cứ thế cho tới 6 giờ sáng hôm sau). Trong 1 đêm có 3 người mồi chia làm 3 ca và thực hiện như vậy trong 4 đêm cho mỗi điểm điều tra, vị trí mồi muỗi: chọn nơi kín gió, yên tỉnh để ngồi, cách cửa sổ được mở gần nơi mồi để muỗi bay vào.
+ Mồi người ngoài nhà rẫy ban đêm (MNNN): điểm mồi người ngoài nhà nằm gần nhà mồi muỗi trong nhà đã được chọn để bắt muỗi. Vị trí ngồi
mồi muỗi, cách nhà khoảng 30-50 m tùy thuộc vào địa hình xung quanh nhà mồi. Không ngồi cạnh chuồng gia súc (cách 100 m trở lên). Thời gian mồi từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau (như mồi trong nhà). Số người mồi cũng giống như MNTN, vị trí mồi muỗi: chọn nơi kín gió, yên tỉnh để ngồi.
Người làm mồi bắt muỗi ở tư thế ngồi, quần được xăn lên quá gối để 2 chân lộ ra, ngồi yên chờ muỗi đến đốt để bắt. Sau 1-2 phút dùng đèn pin soi một lần để kiểm tra xem có muỗi hay không, khi soi đèn xem không nên soi đèn trực tiếp vào để tránh làm muỗi kích động bay đi mất. Khi phát hiện có muỗi một tay cầm đèn pin soi, một tay cầm ống tube chuyên dụng khéo léo chụp lên muỗi đang đậu trên chân, khi đã chụp được muỗi thì dùng ngòn tay trỏ cầm tube lựa tư thế đúng bịt đầu ống tube đang úp muỗi khi thấy muỗi đã vào trong ống tube thì đưa ra và dùng bông bịt đầu tube lại và ghi lại thời gian bắt muỗi.
Kỹ thuật soi muỗi trên tường vách trong nhà rẫy ban đêm:
Mục đích của phương pháp này là xác định thành phần loài, mật độ các loài Anopheles, có tập tính đậu rình mồi trước khi đốt mồi hoặc đậu nghỉ tạm thời sau khi đốt máu. Đánh giá tác dụng của hóa chất phun tẩm trong nhà.
Thời gian tiến điều tra theo giờ mồi muỗi ban đêm, mỗi giờ soi 10 phút trên tường, mái nhà thấp, trên màn… những nơi mà muỗi có thể đậu để rình mồi. Kỹ thuật bắt muỗi, tay phải cầm đèn pin tay trái cầm tube soi vào các vị trí vách trong, ngoài mà muỗi có thể đậu, khi thấy muỗi dùng tube ở tay phải bắt muỗi, lựa tư thế thuận lợi, nhẹ nhàng để bắt muỗi, khi bắt được muỗi dùng bông đậy ống tube lại và tiếp tục soi.
Kỹ thuật soi muỗi trong nhà rẫy ban ngày (SNN):
- Nhằm xác định thành phần loài, mật độ, tập tính muỗi Anopheles tiêu máu trong nhà; nhằm xác định vị trí, độ cao, giá thể nơi muỗi trú đậu tiêu máu. Bắt muỗi trú đậu trong nhà rẫy ban ngày thời gian từ 6 giờ đến 10 giờ trong 4 ngày cho mỗi điểm nghiên cứu, mỗi điểm chọn 10 nhà phân bố đều ở
các vị trí trong làng để bắt muỗi. Tay phải người điều tra cầm ống tube, tay trái cầm đèn pin tìm muỗi từ cửa ra vào và đi dần vào trong, vừa đi vừa dùng đèn quan sát những nơi muỗi có thể trú đậu trong nhà (quần áo, chăn màn, nơi kín gió, ánh sáng yếu …), đèn cách tường 30 - 40 cm, độ cao từ 2 m trở xuống. Khi thấy muỗi dùng ống tube bắt muỗi, dùng tư thế thích hợp để úp muỗi khi muỗi đã vào trong ống tube dùng ngón tay trỏ bịt đầu tube và dùng bông không thấm nước bịt đầu ống có muỗi lại. Ghi lại những thông tin cần thiết như: Điểm thu thập bắt muỗi, huyện xã, số nhà, nơi đậu, độ cao so với sàn nhà của từng con, từng loài, số sella của muỗi.
2.4.2.3. Kỹ thuật điều tra bọ gậy
Mục đích: Nhằm xác định thành phần loài, mật độ bọ gậy Anopheles ở các thủy vực đặc trưng cho từng loài. Bọ gậy được thu thập ở các thủy vực quanh khu vực nhà rẫy, mỗi thủy vực 100 bát/đợt/điểm điều tra.
+ Thu thập bọ gậy đối với những thủy vực nhỏ: bằng cách đi 2 bên bờ suối, lòng suối cạn, vũng nước ở trong rừng, rẫy… dùng bát chuyên dụng bắt bọ gậy hớt nhẹ nước và quan sát dùng ống hút bắt bọ gậy cho vào lọ đưa về.
+ Tìm bọ gậy ở những thủy vực lớn bằng cách: đi 2 bên bờ sông, suối, kênh, mương dùng vợt chuyên dụng để bắt bọ gậy ở các thủy vực tìm kiếm. Đặt khung vợt thẳng góc với mặt nước, một nửa vợt nằm trên mặt nước, một nửa dưới mặt nước, chuyển một đoạn dài chậm chậm song song dài 2,5 m rồi kéo vợt lên, lật ngược vợt vào khay men, dùng ống hút bắt bọ gậy cho vào lọ; ở mỗi điểm dùng vợt bắt một đoạn dài khoảng 20 m.
2.4.2.4. Kỹ thuật định loại muỗi và bọ gậy bằng hình thái ngoài
Sử dụng bảng định loại Anopheles của Viện Sốt rét-KST-CT Trung Ương (2008). Mục đích, dựa trên các đặc điểm hình thái ngoài để phân biệt các loài với nhau, với nhiều loài Anopheles có vai trò truyền bệnh sốt rét, giữa các loài lại có sai khác về đặc tính sinh học, sinh thái học, phân bố, và
vai trò truyền bệnh… Xác định loài là rất quan trọng để xác định đúng các loài truyền bệnh để có biện pháp phòng chống các véc tơ tại địa phương đó.
- Kỹ thuậtđịnh loại muỗi Anopheles
Cho muỗi trong tube bắt được vào đĩa petri, dùng kim mổ muỗi cắm vào ngực muỗi ở giữa đôi chân thứ 2, hơi chếch về phía sau và cho cánh muỗi xòe ra.
Định loại muỗi bằng cách quan sát muỗi bằng kính lúp tay có độ phóng đại 10x, hoặc kính lúp 2 mắt có độ phóng đại 20x, xác định các đặc điểm sau: Muỗi đực hay cái, muỗi Anophelinae hay muỗi Culicinae, costa gián đoạn hay không gián đoạn, chân có hoa hay không có hoa, các đốt bàn chân sau có điểm trắng hay không có điểm trắng. Sau khi đã nhận định được các đặc điểm của muỗi cần định loại và quan sát muỗi cần định loại theo bảng định loại và so sánh các điểm giống và khác nhau của từng loài trên bảng định loại, xác định loài.
- Kỹ thuậtđịnh loại bọ gậy Anopheles
Dùng ống hút hút bọ gậy cho vào chén nhôm có một ít nước lạnh sau đó hơ chén nước có bọ gậy trên ngọn lửa đèn cồn cho tới khi bọ gậy chết (nhiệt độ khoảng 700C tránh để bọ gậy dẫy dụa nhiều để không làm rụng lông bọ gậy) khi bọ gậy đã chết dùng ống hút hút bọ gậy đặt lên lam kính, bọ gậy được đặt nằm sấp, đầu hướng về người soi định loại, dùng lamen đặt lên trên bọ gậy, không di chuyển nhiều làm rụng lông và mất đi các đặc điểm định loại bọ gậy. Dùng kính hiển vi vật kính 10x quan sát tổng quát bọ gậy, sau đó dùng vật kính 40x quan sát các đặc điểm chi tiết bọ gậy và so sánh với bảng định loại bọ gậy để xác định loài bọ gậy (chỉ định loại bọ gậy tuổi 3, 4 không định loại bọ gậy tuổi 1, 2 chưa đủ đặc điểm định loại).
2.4.2.5.Kỹ thuật mổ muỗi
Theo phương pháp của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 1975)
Mục đích, tìm thoa trùng trong tuyến nước bọt, Oocyste trong dạ dày, xác định muỗi đẻ hay chưa đẻ và tuổi sinh lý của muỗi. Gây mê muỗi bằng
Ether hay Chloroform, trước khi mổ dùng kính lúp định loại muỗi, xác định sella muỗi. Đặt muỗi lên lam kính ở 3 giọt nước muối sinh lý 9‰, mỗi giọt cách nhau 0,5 cm. Đưa lam kính vào kính lúp, muỗi đực đặt vào giọt nước ở giữa, đầu muỗi hướng về bên phải, bụng muỗi hướng về phía người mổ. Tay trái người mổ muỗi cầm kim đè nhẹ lên ngực muỗi chỗ đôi chân thứ 2, tay phải cầm kim đặt nhẹ vào cổ muỗi và kéo nhẹ, các tuyến nước bọt theo đầu muỗi sẽ được lôi ra. Dùng kim cắt các tuyến nước bọt ra khỏi đầu và đưa sang giọt nước bên tay phải. Dùng kim xé và tách rách một ít kitin ở đốt cuối cùng (đốt 8). Đặt kim phải lên trên ngực muỗi, kim trái lên đốt cuối cùng và kéo dần kim sang phía trái cho đến khi dạ dày và 2 buồng trứng được lôi ra khỏi bụng muỗi. Vớt xác muỗi ra khỏi lam kính cho vào tube epenfdor để thử nghiệm ELISA. Tách 2 buồng trứng sang giọt nước bên trái, dạ dày vẫn giữ nguyên ở giọt nước giữa. Quan sát tuyến nước bọt để tìm thoa trùng. Quan sát dạ dày để tìm Oocyste. Quan sát hệ thống khí quản ở buồng trứng muỗi để phân biệt muỗi đã đẻ hay chưa đẻ. Muỗi chưa đẻ khí quản cuộn lại thành từng bó, muỗi đã đẻ khí quản giãn ra.
2.4.2.6.Kỹ thuật ELISA xác định muỗi nhiễm ký sinh trùng sốt rét
Kỹ thuật ELISA xác định muỗi nhiễm KSTSR: Các cá thể muỗi (loài là véc tơ) chết và xác muỗi mổ sẽ được bảo quản trong tube Eppendorf để thử nghiệm ELISA tại phòng thí nghiệm của Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn nhằm xác định muỗi nhiễm KSTSR. Quy trình ELISA được thực hiện theo Wirtz và cs (1985, 1987).
Nguyên lý phương pháp: dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên bề mặt của thoa trùng sốt rét trong muỗi với các kháng thể đơn dòng và kháng thể đơn dòng có gắn các chất oxy hóa để giúp phát hiện màu. Phản ứng tóm tắt như sau: Kháng thể+kháng nguyên (từ mẫu vật)+kháng thể có gắn chất oxy hóa+chất hiện màu=dương tính để phát hiện KSTSR trong cơ thể muỗi [13].
Các bước tiến hành theo quy trình: Quy trình ELISA được tiến hành theo các bước: Đĩa (Plate) thử nghiệm ELISA có 96 giếng (8 x12), được phủ bằng 50l kháng thể đơn dòng MAb P.f 2A10, Pv 210, Pv 247, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Dung dịch trong giếng được đổ ra, 200 l dung dịch blocking buffer (BB) được cho vào mỗi đĩa, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Dung dịch trong giếng được đổ ra. Làm khô đĩa. 50l dung dịch muỗi nghiền được cho vào 1 giếng, chứng dương (+) và chứng âm (-) được cho vào các giếng qui định. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS - Tween. Làm khô đĩa. 50 l enzyme liên kết kháng thể (peroxidase- conjugated MAbs) của P.f 2A10, P.v 210, P.v247 được cho vào các giếng. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng. Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS - Tween. Làm khô đĩa. 100 l cơ chất của enzyme được cho vào các giếng. Đọc kết quả ở máy đọc ELISA, bước sóng 405 nm.
2.4.2.7. Các chỉ tiêu đánh giá về véc tơ sốt rét được theo dõi
- Mật độ muỗi Anopheles từng loài được tính bằng công thức: Số muỗi bắt được của một loài Mật độ (con/người/đêm) = ---
Số người bắt x Số đêm bắt - Mật độ muỗi Anopheles thu thập bằng bẫy đèn tính bằng công thức:
Tổng số muỗi thu thập Mật độ (con/đèn/đêm) = --- Số bẫy đèn x Số đêm - Mật độ muỗi Anopheles thu thập bằng kỹ thuật soi nhà ngày:
Tổng số muỗi bắt được của từng loại Mật độ (con/nhà) = ---
- Mật độ muỗi Anopheles thu thập bằng kỹ thuật soi tường vách ban đêm : Tổng số muỗi bắt được của từng loại Mật độ (con/nhà/đêm) = ---
Tổng số nhà điều tra
- Tỷ lệ muỗi nhiễm KSTSR(S) bằng ELISA được tính bằng công thức: Tổng số muỗi nhiễm KSRST
S (%) = --- x 100 Tổng số muỗi thử ELISA
- Thời gian chu kỳ tiêu sinh (l), (Theo Beklemishev,1940): 37
l = --- +1 t - 9 Trong đó:
t: nhiệt độ trung bình của môi trường hằng ngày 37: tổng lượng nhiệt hữu hiệu
9: nhiệt độ tối thiểu cho muỗi phát triển
1: khoảng thời gian 1 ngày để muỗi tìm nơi đẻ trứng và tìm mồi đốt - Tỷ lệ muỗi đã đẻ được tính bằng công thức:
Tổng số muỗi đẻ rồi
Tỷ lệ muỗi đã đẻ (%) = --- x 100