4. Bố cục của luận văn
1.4.1. Nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trên thế giới
Có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh trên thế gới nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt.
Chen và cộng sự (2004) [31] đã tiến hành phân lập 3 gen Hsc70 ở đậu xanh là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng.
Theo Sadeghipour (2008) [43], khi bị hạn bất kể ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng hay sinh thực đều làm giảm các yếu tố cấu thành năng suất đậu xanh và năng suất hạt, tuy nhiên hạn ở giai đoạn nở hoa và hình thành quả ảnh hưởng đến năng suất hạt nghiêm trọng hơn so với các giai đoạn khác. Khô hạn nếu xảy ra ở thời kỳ ra hoa (xuất hiện hoa đầu tiên đến 75% số quả non được hình thành) làm giảm số quả/cây, số hạt/quả và năng suất hạt, nếu gặp hạn ở thời kỳ quả mẩy (75% quả non đến quả chín) làm giảm đáng kể khối lượng 1000 hạt.
Ranawake và cộng sự (2011) [42] nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn đối với sinh trưởng và năng suất của đậu xanh thấy rằng điều kiện hạn ảnh hưởng đáng kể đến chiều dài rễ, số rễ, chiều cao cây, trọng lượng khô, nụ hoa.
Ranawake và cộng sự (2011) [42] chỉ ra rằng đối với cây đậu xanh, hạn hán xảy ra trong thời kỳ quả mẩy (6 tuần sau khi gieo) bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn so với khi bị hạn ở thời kỳ cây con (3 tuần sau khi gieo) và thời kỳ quả chín (8 tuần sau khi gieo).
Kumar và cộng sự (2013) [36] đã chỉ ra rằng, thiếu nước làm giảm diện tích lá, tốc độ sinh trưởng, sự tăng trưởng bộ rễ, số lượng nốt sần, cường độ quang hợp, hàm lượng chlorophyl và carotenoit, khả năng ra hoa và hình thành quả, khả năng tích lũy chất khô và năng suất hạt. Các giống đậu xanh (Pusa Baisakhi và MH-1 K-24) nhạy cảm với khô hạn cho thấy có sự giảm mạnh các chỉ tiêu sinh lý nêu trên và phục hồi chậm cường độ quang hợp.
Yin Z. và cộng sự (2015) đã nghiên cứu khả năng ảnh hưởng của gây hạn nhân tạo bằng etylen glycol đến đậu xanh giai đoạn ra hoa và thấy rằng
các chỉ số hóa sinh như hoạt động của các enzyme superoxide dismutase, peroxidase, hàm lượng malondialdehyde và hàm lượng ABA có liên quan đến khả năng chịu hạn của đậu xanh [48].
1.4.2. Nghiên cứu về khả năng chịu hạn trên cây đậu xanh ở Việt Nam
Chu Hoàng Mậu (2001) [14] bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao, ổn định và có khả năng chịu hạn tốt. Tác giả cũng đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein, thành phần và hàm lượng các axit amin trong hạt các giống đậu xanh đột biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh. Kết quả cho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là 20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng axit amin của các giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự (2006) [ 20] khi phân lập và đọc trình tự gen mã hóa protein LEA của 4 giống đậu xanh KP11, MN93, 263 và KPS1 có khả năng chịu hạn khác nhau cho biết gen LEA của 4 giống đậu xanh nghiên cứu dài khoảng 516 - 520 nucleotide gồm 2 exon và 1 intron, đoạn mã hóa protein dài 339 nucleotid, so sánh trình tự nucleotid của gen LEA giữa 4 giống đậu xanh nêu trên cho thấy có độ tương đồng cao (95,9 – 99,6%), so sánh mức độ protein cho thấy trình tự axit amin của chúng sai khác rất ít.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Chu Hoàng Mậu (2010) [21] đã nghiên cứu về gen mã hóa cystatin phân lập từ hai giống có khả năng chịu hạn cao (KP11 và KPS1) và hai giống chịu hạn kém (MN93, 263) cho biết, trình tự nucleotide của gen cystatin của bốn giống đậu xanh thể hiện sự khác nhau mặc dù trình tự axit amin không khác biệt nhau và không khác với trình tự có mã số AF454396 ở GenBank.
Vũ Ngọc Thắng và cộng sự (2011) [23] đã đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu xanh ở giai đoạn mọc mầm bằng việc sử dụng PEG- 6000 gây hạn nhân tạo với các mức gây hạn 0, -3, -6, -9, -12, -15 bar, kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra 2 giống đậu xanh ĐX22 và ĐXVN5 có khả năng chịu hạn tốt hơn ở giai đoạn mọc mầm so với các giống khác.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự (2011) [22] cho rằng, gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN2 đều có kích thước 351 bp, chuỗi polypeptide được tổng hợp từ gen LTP gồm 116 amino acid. Khi so sánh với trình tự nucleotide của gen LTP đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số AY300807, trình tự nucleotide của gen LTP ở hai mẫu nghiên cứu có độ tương đồng 98,8%. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein từ 97,4% - 98,2.
Vũ Ngọc Thắng và cộng sự (2012) [24] đã đánh giá khả năng chịu hạn của 2 giống đậu xanh ĐX22 và ĐXVN5 ở 3 thời kỳ bắt đầu ra hoa, ra hoa rộ, quả vào chắc trong điều kiện chậu vại, sử dụng đất phù sa sông Hồng, kết quả nghiên cứu cho thấy nếu hạn ở thời kỳ bắt đầu ra hoa cây có khả năng phục hồi tốt hơn và ảnh hưởng giảm năng suất nhẹ hơn ở các giai đoạn sau. Sự suy giảm năng suất mạnh nhất khi thiếu nước ở thời kỳ quả mẩy, giống ĐX22 có khả năng chịu hạn tốt hơn giống ĐXVN5. Kết quả nghiên cứu này đã góp phần xác định phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của đậu xanh phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở nước ta.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các giống đậu xanh được dùng trong nghiên cứu bao gồm ĐX 044 được Trường Đại học Nông nghiệp I chọn lọc cá thể từ giống VC 2768A. Giống ĐX 208 được tuyển chọn từ giống địa phương ở miền Nam nước ta và NTB.02 được Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ tuyển chọn từ các dòng giống nhập nội.
Bảng 2.1. Đặc điểm nông học của các giống đậu xanh nghiên cứu
Đặc điểm ĐX 044 ĐX 208 NTB.02
Thời gian
sinh trưởng 75 - 80 ngày 70 - 75 ngày 85 - 90 ngày
Chiều cao cây 45 - 50 cm 55 - 70 cm 80 - 90 cm
Khối lượng
1000 hạt 66 - 79 g 65 - 70 g 66 - 70 g
Năng suất 15 - 20 tạ/ ha 20 - 25 tạ/ha 22 - 25 tạ/ha
Khả năng chống chịu It bị bệnh phấn trắng và đốm lá Chống đổ, chống bệnh vàng lá, đốm lá Kháng bệnh héo rũ, chống đổ tốt.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019.
- Địa điểm: Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý-Hóa sinh và vườn Sinh học trường thuộc Khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Quy Nhơn.
2.3.1. Hóa chất và nguyên liệu khác
Thuốc thử Bradford, coomassie brlliant blue R-250, BSA, toluen, ninhydrin được mua từ Biobasic (Canada); glycine betaine chuẩn, proline chuẩn được mua từ Sigma (Mỹ); ethanol, methanol, β-mercaptoethanol, tris- base, guaiacol, 1,2 dichloroethane được mua từ Merck (Đức) và một số hóa chất khác.
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Một số thiết bị chính dùng trong nghiên cứu bao gồm máy ly tâm lạnh (Mikro 22R- Hattich, Đức), máy lắc ngang (Eppendorf, Đức), máy đo pH (Orion, USA), máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB - Ultraspec, Denmark), máy khuấy từ, pipetman các loại (Gilson), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Đức),...
Một số dụng cụ khác như bếp điện, đầu côn các loại, ống eppeendorf, ống falcon 50 ml, 15 ml; ống đong 10 ml và 100 ml, 250 ml; bình tam giác 50 ml, bình định mức 50 ml, chày, cối sứ, cối thủy tinh, găng tay, khẩu trang chống độc...
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện gây hạn nhân tạo và phục hồi đến hàm lượng protein tổng số, hàm lượng proline, hàm lượng glycine betaine và hàm lượng đường khử của lá đậu xanh ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa như catalase, peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
(1) Thời kỳ cây non:
Thí nghiệm gây hạn nhân tạo được tiến hành theo phương pháp của Lê Trần Bình [1]. Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3 lần.
Hạt đậu nảy mầm được gieo trong chậu trồng cây chứa cát sạch. Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường bằng cách bổ sung dung dịch dinh dưỡng Knop, đến ngày thứ 7 sau khi gieo, cây có 3 lá thật, gây héo lô thí nghiệm bằng cách không tưới nước và cách li với nước, lô đối chứng tưới nước bình thường. Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày gây hạn thì tiến hành thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80%. Ẩm độ đất được kiểm tra bằng máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), sau đó tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi.
(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:
Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu xanh bắt đầu ra hoa đầu tiên thì tiến hành gây hạn. Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày hạn thì thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80% và tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi. Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gây hạn và phục hồi cũng tương tự như giai đoạn ra hoa. Thời điểm bắt đầu gây hạn và phục hồi là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non.
2.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [29].
+ Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden. Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115,5 C V P
Trong đó: m : hàm lượng proline (µg/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : thể tích dung môi chiết (ml) P : trọng lượng mẫu phân tích (g)
+ Cách làm: Cân 0,5 g mẫu nghiền trong 10 ml axit sulphosalisilic 3%. Lọc và lấy 2 ml dịch lọc, thêm vào dịch lọc 2 ml ninhydrin và 2 ml axit axetic lạnh, để ở 100oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng ở điều kiện lạnh (ngăn đá). Hỗn hợp được tách chiết bằng 4 ml toluen, trộn mạnh trong 15-20 s, hợp chất màu được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 520 nm. Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị proline chuẩn.
2.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng glycine betaine
Hàm lượng glycine betaine được xác định theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983) [33].
+ Nguyên tắc: phương pháp phân tích glycine betaine bằng Kali triiod (KI-I2) dựa trên hợp chất amoni bậc 4 bị kết tủa bởi iod để tạo thành phức
chất periodide. Phức chất periodide sau đó được chiết xuất bằng 1,2- dichloroethan và dịch này hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 365 nm.
+ Cách tiến hành: Lấy 0,5 g mẫu nghiền trong 5 ml nước cất. Sau đó, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 1 ml dịch chiết, bổ sung thêm 1 ml H2SO4 2N. Chuyển hỗn hợp này vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 0,2 ml dung dịch Kali triiod, toàn bộ hỗn hợp này được làm lạnh bằng đá khoảng 90 phút trên máy lắc. Sau đó bổ sung 2 ml nước cất và 20 ml 1,2-dichloroethan vào hỗn hợp trên. Bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365 nm. Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị glycine betain chuẩn.
2.5.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Betrand [3]. +Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép định lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1-40 mg. Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, mantose,..) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ → Cu1+ ), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử.
+Cách tiến hành: Nghiền kỹ 5 g mẫu với 20 ml nước cất. Chuyển hỗn hợp trên vào bình định mức và dẫn nước tới vạch 100ml. Lấy 5 ml dịch chiết cho vào bình nón và thêm 20 ml thuốc thử. Đun sôi hỗn hợp bên bếp cho đến khi thấy có kết tủa được tạo thành có màu đỏ gạch (Cu2O). Rửa tủa bằng nước nóng cho đến khi hết kềm. Hòa tan tủa bằng Fe2(SO4)3 và chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N.
2.5.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1976) [17]. + Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung
dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài microgam protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
+ Cách làm: Nghiền 1g mẫu lá trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05 M, pH 6,8 chứa β- mercaptoethanol 1%, ly tâm 2 lần ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi làm nguồn protein. Cho vào ống nghiệm 200 µl dung dịch mẫu protein, 2,3 ml dung dịch thuốc thử Bradford, lắc đều, sau 3 phút (nhưng phải trước một giờ) đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Dựng đường chuẩn protein từ dung dịch BSA nồng độ 1 mg/ml, đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa A595 và hàm lượng protein. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein trong mẫu.
2.5.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase:
Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp Bakh – Oparin [3].
+ Nguyên tắc: Dựa vào lượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme catalase bằng cách chuẩn độ với dung dịch KMnO4.
+ Tiến hành: Cân 5 gam lá nghiền với 20 ml nước cất thành dịch đồng thể, cho vào bình định mức 50 ml và dẫn nước đến vạch. Lắc đều hỗn hợp, sau 30 phút đem lọc hoặc li tâm. Lấy 2 bình nón 100 ml, cho vào mỗi bình 2ml dịch lọc. Đun sôi bình kiểm tra 2 phút, làm nguội bình. Thêm vào mỗi bình 20 ml nước cất và 3 ml dung dịch H2O2 1%, để ở nhiệt độ phòng 30 phút, cho thêm 4 ml dung dịch H2SO4 10% và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt không bị mất màu trong 1 phút. Hoạt độ của enzyme được tính theo công thức sau:
(A - B) x 1.7 x V1
W x V2
Trong đó: X: hoạt độ enzyme catalase
A: số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. B: số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm.
V1: tổng thể dung dịch enzym (ml)
V2: số ml dung dịch enzym để phân tích (ml) 1,7: số ml H2O2 tương ứng với ml KMnO4 0,1 N W: khối lượng nguyên liệu mẫu (g).
2.5.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase
Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik và Singh (1980).
+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol, amin có nhân thơm. Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol và