4. Bố cục của luận văn
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019.
- Địa điểm: Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý-Hóa sinh và vườn Sinh học trường thuộc Khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Quy Nhơn.
2.3.1. Hóa chất và nguyên liệu khác
Thuốc thử Bradford, coomassie brlliant blue R-250, BSA, toluen, ninhydrin được mua từ Biobasic (Canada); glycine betaine chuẩn, proline chuẩn được mua từ Sigma (Mỹ); ethanol, methanol, β-mercaptoethanol, tris- base, guaiacol, 1,2 dichloroethane được mua từ Merck (Đức) và một số hóa chất khác.
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Một số thiết bị chính dùng trong nghiên cứu bao gồm máy ly tâm lạnh (Mikro 22R- Hattich, Đức), máy lắc ngang (Eppendorf, Đức), máy đo pH (Orion, USA), máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB - Ultraspec, Denmark), máy khuấy từ, pipetman các loại (Gilson), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Đức),...
Một số dụng cụ khác như bếp điện, đầu côn các loại, ống eppeendorf, ống falcon 50 ml, 15 ml; ống đong 10 ml và 100 ml, 250 ml; bình tam giác 50 ml, bình định mức 50 ml, chày, cối sứ, cối thủy tinh, găng tay, khẩu trang chống độc...
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện gây hạn nhân tạo và phục hồi đến hàm lượng protein tổng số, hàm lượng proline, hàm lượng glycine betaine và hàm lượng đường khử của lá đậu xanh ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa như catalase, peroxidase của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
(1) Thời kỳ cây non:
Thí nghiệm gây hạn nhân tạo được tiến hành theo phương pháp của Lê Trần Bình [1]. Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3 lần.
Hạt đậu nảy mầm được gieo trong chậu trồng cây chứa cát sạch. Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường bằng cách bổ sung dung dịch dinh dưỡng Knop, đến ngày thứ 7 sau khi gieo, cây có 3 lá thật, gây héo lô thí nghiệm bằng cách không tưới nước và cách li với nước, lô đối chứng tưới nước bình thường. Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày gây hạn thì tiến hành thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80%. Ẩm độ đất được kiểm tra bằng máy đo độ ẩm Takemura DM-15 (Nhật Bản), sau đó tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi.
(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:
Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu xanh bắt đầu ra hoa đầu tiên thì tiến hành gây hạn. Sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày hạn thì thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. Ở giai đoạn phục hồi, lô thí nghiệm gây hạn 5 ngày được tưới nước phục hồi sao cho ẩm độ đất luôn được duy trì từ 75 – 80% và tiến hành thu mẫu lá và phân tích vào các thời điểm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày phục hồi. Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gây hạn và phục hồi cũng tương tự như giai đoạn ra hoa. Thời điểm bắt đầu gây hạn và phục hồi là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non.
2.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [29].
+ Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden. Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115,5 C V P
Trong đó: m : hàm lượng proline (µg/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : thể tích dung môi chiết (ml) P : trọng lượng mẫu phân tích (g)
+ Cách làm: Cân 0,5 g mẫu nghiền trong 10 ml axit sulphosalisilic 3%. Lọc và lấy 2 ml dịch lọc, thêm vào dịch lọc 2 ml ninhydrin và 2 ml axit axetic lạnh, để ở 100oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng ở điều kiện lạnh (ngăn đá). Hỗn hợp được tách chiết bằng 4 ml toluen, trộn mạnh trong 15-20 s, hợp chất màu được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 520 nm. Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị proline chuẩn.
2.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng glycine betaine
Hàm lượng glycine betaine được xác định theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983) [33].
+ Nguyên tắc: phương pháp phân tích glycine betaine bằng Kali triiod (KI-I2) dựa trên hợp chất amoni bậc 4 bị kết tủa bởi iod để tạo thành phức
chất periodide. Phức chất periodide sau đó được chiết xuất bằng 1,2- dichloroethan và dịch này hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 365 nm.
+ Cách tiến hành: Lấy 0,5 g mẫu nghiền trong 5 ml nước cất. Sau đó, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 1 ml dịch chiết, bổ sung thêm 1 ml H2SO4 2N. Chuyển hỗn hợp này vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 0,2 ml dung dịch Kali triiod, toàn bộ hỗn hợp này được làm lạnh bằng đá khoảng 90 phút trên máy lắc. Sau đó bổ sung 2 ml nước cất và 20 ml 1,2-dichloroethan vào hỗn hợp trên. Bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365 nm. Xác định hàm lượng proline dựa vào đồ thị glycine betain chuẩn.
2.5.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Betrand [3]. +Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép định lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1-40 mg. Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, mantose,..) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ → Cu1+ ), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử.
+Cách tiến hành: Nghiền kỹ 5 g mẫu với 20 ml nước cất. Chuyển hỗn hợp trên vào bình định mức và dẫn nước tới vạch 100ml. Lấy 5 ml dịch chiết cho vào bình nón và thêm 20 ml thuốc thử. Đun sôi hỗn hợp bên bếp cho đến khi thấy có kết tủa được tạo thành có màu đỏ gạch (Cu2O). Rửa tủa bằng nước nóng cho đến khi hết kềm. Hòa tan tủa bằng Fe2(SO4)3 và chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N.
2.5.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1976) [17]. + Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung
dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài microgam protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
+ Cách làm: Nghiền 1g mẫu lá trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05 M, pH 6,8 chứa β- mercaptoethanol 1%, ly tâm 2 lần ở 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi làm nguồn protein. Cho vào ống nghiệm 200 µl dung dịch mẫu protein, 2,3 ml dung dịch thuốc thử Bradford, lắc đều, sau 3 phút (nhưng phải trước một giờ) đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Dựng đường chuẩn protein từ dung dịch BSA nồng độ 1 mg/ml, đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa A595 và hàm lượng protein. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein trong mẫu.
2.5.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase:
Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp Bakh – Oparin [3].
+ Nguyên tắc: Dựa vào lượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme catalase bằng cách chuẩn độ với dung dịch KMnO4.
+ Tiến hành: Cân 5 gam lá nghiền với 20 ml nước cất thành dịch đồng thể, cho vào bình định mức 50 ml và dẫn nước đến vạch. Lắc đều hỗn hợp, sau 30 phút đem lọc hoặc li tâm. Lấy 2 bình nón 100 ml, cho vào mỗi bình 2ml dịch lọc. Đun sôi bình kiểm tra 2 phút, làm nguội bình. Thêm vào mỗi bình 20 ml nước cất và 3 ml dung dịch H2O2 1%, để ở nhiệt độ phòng 30 phút, cho thêm 4 ml dung dịch H2SO4 10% và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt không bị mất màu trong 1 phút. Hoạt độ của enzyme được tính theo công thức sau:
(A - B) x 1.7 x V1
W x V2
Trong đó: X: hoạt độ enzyme catalase
A: số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. B: số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm.
V1: tổng thể dung dịch enzym (ml)
V2: số ml dung dịch enzym để phân tích (ml) 1,7: số ml H2O2 tương ứng với ml KMnO4 0,1 N W: khối lượng nguyên liệu mẫu (g).
2.5.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase
Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik và Singh (1980).
+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol, amin có nhân thơm. Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol và guaiacol chính là cơ chất.
+ Tiến hành: Nghiền 1 g mẫu lá đậu xanh trong 3 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,0. Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 4°C. Lấy dịch trong làm nguồn enzyme. Hút 3 ml dung dịch đệm photphat, thêm vào 0,05 ml dung dịch guaiacol có nồng độ 20 mM; thêm 0,1 ml dịch chiết enzyme, sau đó cho 0,03 ml H2O2 0,042%. Lắc kỹ hỗn hợp, đo quang phổ ở bước sóng 436 nm.
2.5.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả nghiên cứu được đánh giá theo phương pháp toán thống kê qua các thông số: Giá trị trung bình mẫu ( X ), độ lệch chuẩn (δ), sai số trung bình (m). - Trung bình mẫu: n Xi X n i 1
n : số lượng mẫu nghiên cứu
Xi: giá trị đo đếm ở mỗi lần nhắc lại
- Độ lệch chuẩn: 1 ) ( 1 2 n X Xi n i (n30) - Sai số trung bình: n m .
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sự biến động các chất có hoạt tính thẩm thấu trong cây đậu xanh trong điều kiện gây hạn và phục hồi
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nước do hạn, mặn, lạnh…Những thực vật sống trong môi trường thiếu nước bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại được điểu kiện khắc nghiệt đó. Cây trồng sống trong môi trường hạn có thể hạn chế sự thiếu nước nhờ tổng hợp và tích lũy các chất hòa tan, protein, axit amin đặc hiệu…, được xem là một cơ chế quan trọng để cây duy trì sự sinh trưởng trong điều kiện thiếu nước.
3.1.1. Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi
Đường khử có mặt trong tế bào có vai trò điều chỉnh áp suất thẩm thấu dịch bào, khi thực vật gặp điều kiện stress phi sinh học. Vì vậy khảo sát hàm lượng đường khử trong cây đậu xanh để tìm mối tương quan về khả năng chịu hạn của đậu xanh là rất cần thiết.
3.1.1.1. Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non
Hàm lượng đường khử trong lá đậu xanh ở giai đoạn cây non được trình bày ở bảng 3.1.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng đường khử có sự khác nhau giữa các giống và hàm lượng đường tăng trong giai đoạn cây non khi xử lý sau 1 ngày hạn đến 5 ngày hạn. Khi gây hạn thì các công thức thí nghiệm có hàm lượng đường khử cao hơn so với công thức đối chứng. Điều này chứng tỏ cây đậu xanh đã có phản ứng tích cực trước điều kiện thiếu nước. Ngoài ra, sự tăng lên về hàm lượng đường khử còn tùy thuộc vào từng giống khác nhau.
Sau 1 ngày gây hạn, hàm lượng đường khử ở giống NTB.02 tăng 5,52% so với đối chứng, tỷ lệ này ở giống ĐX 208 là 6,29% và ở giống ĐX 044 là 9,04%.
Sau 3 ngày gây hạn, hàm lượng đường khử trong lá ở cả 3 giống đều tăng lên rõ rệt. Với giống NTB.02, hàm lượng đường khử đã tăng lên 13,94% so với lô đối chứng, giống ĐX 208 tăng 14,36%; tỷ lệ tăng cao nhất thể hiện rõ ở giống ĐX 044, tăng 18,46% so với đối chứng.
Bảng 3.1. Hàm lượng đường khử trong lá cây đậu xanh ở giai đoạn cây non (%)
Giống
Hàm lượng đường khử (%)
Gây hạn Phục hồi
1 ngày 3 ngày 5 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày
NTB.02 ĐC 1,63±0,015 1,65±0,01 1,68±0,017 1,73±0,01 1,72±0,017 1,74±0,015 TN 1,72±0,012 1,88±0,01 2,01±0,012 1,91±0,015 1,81±0,012 1,76±0,01 %ĐC 105,52% 113,94% 119,64% 110,40% 105,23% 101,15% ĐX 208 ĐC 1,75±0,012 1,81±0,015 1,95±0,01 1,97±0,025 1,96±0,015 1,97±0,01 TN 1,86±0,015 2,07±0,01 2,35±0,01 2,21±0,015 2,08±0,012 2,01±0,015 %ĐC 106,29% 114,36% 120,51% 112,18% 106,12% 102,03% ĐX 044 ĐC 1,88±0,015 1,95±0,012 2,08±0,015 2,13±0,01 2,15±0,01 2,15±0,012 TN 2,05±0,012 2,31±0,012 2,57±0,01 2,39±0,012 2,3±0,01 2,21±0,01 %ĐC 109,04% 118,46% 123,56% 112,21% 106,98% 102,79% Sau 5 ngày gây hạn, hàm lượng đường khử ở giống NTB.02 tăng 19,64% so với đối chứng, giống ĐX 208 tăng 20,51% và tăng cao nhất vẫn là giống ĐX 044, tăng 23,56% so với đối chứng. Như vậy, trong điều kiện thiếu nước, hàm lượng đường khử tăng nhiều ở giai đoạn cây non.
Sau khi tưới nước trở lại, hàm lượng đường khử có sự biến động qua các ngày phục hồi. Cụ thể, giống NTB.02, sau 1 ngày phục hồi, hàm lượng đường khử có trong mẫu thí nghiệm cao hơn đối chứng là 10,40%, sau 3 ngày cao hơn 5,23% và cao hơn 1,15% sau 5 ngày. Giống ĐX 208, sự khác biệt giữa
hàm lượng đường khử có trong lá giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm sau 1 ngày, 3 ngày và 5 ngày lần lượt là 112,18%, 106,12% và 102,03%. Ở giống ĐX 044, hàm lượng đường khử cũng giảm dần qua từng ngày phục hồi. Sau 1 ngày phục hồi, hàm lượng đường khử tăng 12,21%; sau 3 ngày và 5 ngày, sự khác biệt giảm dần, hàm lượng đường khử giảm lần lượt xuống còn 6,98% và 2,79% so với đối chứng. Như vậy có sự biến động hàm lượng đường khử trong lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi. Điều này chứng tỏ cây đậu xanh đã có những biến đổi sinh lý, hóa sinh mạnh mẽ trước điều kiện thiếu nước.
Đồ thị 3.1. Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây non
3.1.1.2. Sự biến động hàm lượng đường khử của lá đậu xanh trong quá trình gây hạn và phục hồi ở giai đoạn cây ra hoa
Sự biến động hàm lượng đường khử của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 3.2.
Qua bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy có sự biến động về hàm lượng đường khử ở giai đoạn cây ra hoa tương tự như giai đoạn cây non, nghĩa là thời gian
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
1 ngày 3 ngày 5 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày
Gây hạn Phục hồi H ÀM L Ư Ợ NG NTB.02 ĐC NTB.02 TN ĐX.208 ĐC ĐX.208 TN ĐX.044 ĐC ĐX.044 TN
gây hạn càng dài thì hàm lượng đường khử càng tăng và mức độ tăng phụ thuộc vào từng giống. Cụ thể như sau:
Ở giống NTB.02, sau 1 ngày gây hạn, hàm lượng đường khử có trong mẫu thí nghiệm tăng 12,57% so với mẫu đối chứng, tăng 25,15% sau 3 ngày gây hạn và tăng cao nhất sau 5 ngày, đạt 35,8%.
Đối với giống ĐX 208, hàm lượng đường khử tăng 17,14% so với đối chứng sau 1 ngày gây hạn, tăng 28,18% sau 3 ngày gây hạn và tăng cao nhất sau 5 ngày gây hạn, đạt 42,78%.
Đối với giống ĐX 044, sau 1 ngày và 3 ngày gây hạn, hàm lượng đường khử ở mẫu thí nghiệm tăng lên so với mẫu đối chứng lần lượt là 23,24% và