3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.5.1. Gel polyacrylamide có SDS (SDS – PAGE)
Kỹ thuật điện di được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu hóa sinh và sinh học phân tử nhằm mục đích phân tách các hợp chất. Ngoài ra, điện di có thể dùng trong việc đánh giá độ tinh sạch hay nhận dạng một số hợp chất quan tâm. Cơ sở của điện di chính là sự di chuyển khác nhau của các phân tử mẫu tích điện trong điện trường. Mẫu protein được điện di trên giá thể, phổ biến nhất là gel polyacrylamide.
Gel polyacrylamide được tạo thành do phản ứng trùng hợp giữa acylamide và bis-acrylamide nhờ sự xúc tác của amonium persulphate (APS) và TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylendiamin). Tùy theo nồng độ polyacrylamide mà gel tạo thành có lỗ nhỏ, vừa hay to. Có thể điều chỉnh kích thước lỗ gel cho phù hợp với từng loại thí nghiệm, từng loại mẫu.
Nồng độ bis-acrylamide quyết định mức độ liên kết chéo của gel. Từ đó, quyết định kích thước lỗ gel (lỗ gel càng bé thì nồng độ bis-acylamide càng lớn). Kích thước lỗ gel polyacrylamide được xác định bởi 2 thông số: tổng lượng chất rắn (%T) và tỷ số của liên kết ngang đối với đơn thể acrylamide và liên kết ngang trong dung dịch (%).
Polyacrylamide thường được chuẩn bị ở nồng độ gốc 30% tùy thuộc vào kích thước mẫu sẽ chọn nồng độ gel polyacrylamide phù hợp thường từ 4- 20%. Nồng độ gel polyacrylamide và giới hạn phân tách của gel phụ thuộc vào kích thước của protein cần phân tách [19].
Phương pháp SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gelelectrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel polyacrylamide không liên tục và mẫu protein được gây biến tính.
Điện di biến tính là loại điện di mà người ta bổ sung những chất làm biến tính phân tử mẫu (protein). Do phân tử protein có thể tích điện âm hoặc dương, hoặc không tích điện tại một giá trị pH nào đó. Vì vậy, để đồng nhất khả năng di chuyển trong điện trường, người ta bổ sung vào mẫu cũng như đệm chạy chất sodeum dodecyl sulphate (SDS) có tác dụng phá vỡ cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein, làm cho cấu trúc của chuỗi polypeptide duỗi thẳng đồng thời làm cho tất cả protein tích điện âm. Như vậy, sự di chuyển trong điện trường của các protein khác nhau chỉ còn bị ảnh hưởng bởi sự khác nhau về kích thước hay khối lượng phân tử. Chất thứ hai cũng được dùng trong điện di biến tính là một chất có tính khử, thông thường là beta mercaptoethanol (β-ME) hay dithiothreitol(DTT), một trong hai chất này khi được bổ sung vào mẫu làm cho các cầu disulfide (-S-S-) trong phân tử (nội chuỗi hay nối các chuỗi peptide với nhau) bị bẻ gãy (bị khử thành dạng–SH). Vì vậy, các protein tồn tại ở dạng các chuỗi polypeptide tách rời nhau và sẽ di chuyển trong điện trường một cách riêng rẽ.
Có rất nhiều hệ thống gel điện di polyacrylamide (PAGE) khác nhau đã được phát triển, tuy nhiên cho đến nay, phương pháp của Laemmli (1970) được sử dụng nhiều nhất. Thông thường, trong điện di polyacylamide người ta dùng gel hai lớp (hay còn gọi là điện di không liên tục).
Lớp gel cô (stacking gel) có tác dụng làm cho các phân tử mẫu khi đi qua lớp gel này thì được cô lại thành những băng gọn, nhờ đó khi đi vào hệ thống gel tách sẽ được tách ra dưới dạng các băng sắc nét, tách bạch lẫn nhau. Lớp gel cô thường có chiều cao bằng 1/10 -1/8 lớp gel tách, nồng độ gel cô thường là 3-4%.
Lớp gel phân tách (separating gel) có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel cô và nằm phía dưới, tách các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein [19].