3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định
2.4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [29]. + Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden. Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thú hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115, 5 C V P
Trong đó: m là hàm lượng proline (µmol/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : Thể tích dung môi chiết (ml) P : Trọng lượng mẫu phân tích (g)
+ Cách làm: Cân 0,5g mẫu nghiền trong axit sulphosalisilic 3%. Lọc và lấy 2 ml dịch lọc, thêm vào dịch lọc 2 ml ninhydrin và 2 ml axit axetic. Cho hỗn hợp trên vào tủ ấm ở 100oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng ở điều kiện lạnh. Hỗn hợp được tách chiết bằng 4 ml toluen, hợp chất màu được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 520 nm.
2.4.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng glycine betaine
Hàm lượng glycine betaine được xác định theo phương pháp của Grieve và Grattan (1983) [35].
+ Nguyên tắc: phương pháp phân tích glycine betaine bằng Kali triiod (KI-I2) dựa trên hợp chất amoni bậc 4 bị kết tủa bởi iod để tạo thành phức chất periodide. Phức chất periodide sau đó được chiết xuất bằng 1,2- dichloroethan và dịch này hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 365 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn glycine betaine, xác định được hàm lượng glycine betaine trong mẫu thí nghiệm.
+ Cách tiến hành: Lấy 0,5 g mẫu, nghiền trong 5 ml nước cất. Sau đó, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 1 ml dịch chiết, bổ sung thêm 1 ml H2SO4 2N. Chuyển hỗn hợp này vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 0,2 ml dung dịch kali triiod, toàn bộ hỗn hợp này được làm lạnh bằng đá khoảng 90 phút trên máy lắc. Sau đó bổ sung 2 ml nước cất và 20 ml 1,2-dichloroethan lạnh vào hỗn hợp trên. Đảo đều hỗn hợp trong khoảng 1-2 phút trong điều kiện lạnh, lớp chất hữu cơ phía dưới được đo ở bước sóng 365 nm.
2.4.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp Betrand [2]. +Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép định lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1-40 mg. Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, mantose,..) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit ( Cu2+ → Cu1+ ), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử.
+Cách tiến hành: Nghiền kỹ 2g mẫu với 20 ml nước cất. Chuyển hỗn hợp trên vào bình định mức và dẫn nước tới vạch 100ml. Lấy 5 ml dịch chiết cho vào bình nón và thêm 20 ml thuốc thử. Đun sôi hỗn hợp bên bếp cho đến khi thấy có kết tủa được tạo thành có màu đỏ gạch (Cu2O). Rửa tủa bằng nước nóng cho đến khi hết kềm. Hòa tan tủa bằng Fe2(SO4)3 và chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N.
2.4.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford (1976) [19].
+ Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue (CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài microgam protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
+ Cách làm: Nghiền 1g mẫu lá đậu tương trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,05 M, pH 6.8 chứa β- mercaptoethanol 1%, ly tâm 2 lần ở 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi làm nguồn protein. Cho vào ống nghiệm 200 µl dung dịch mẫu protein, 2,3ml dung dịch thuốc thử Bradford, lắc đều, sau 3 phút, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm.
Dựng đường chuẩn protein từ dung dịch BSA nồng độ 1 mg/ml, đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa A595 và hàm lượng protein. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein có trong mẫu.
2.4.2.5. Phương pháp điện di protein
Protein tổng số được điện di trên gel polyacrylamide có SDS theo hệ thống Laemmli (1970) [19].
+ Nguyên tắc: Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm. Khi protein được chạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein–SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamide với vận tốc phụ thuộc vào kích thước phân tử. Khi đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác nhau. Các băng protein được nhuộm CBB, tiến hành quan sát, phân tích và chụp lại hình ảnh.
+ Tách chiết protein tổng số từ lá đậu tương:
Nghiền 0,2 g mẫu đậu tương với 200 µl dung dịch ly trích (sucrose 5% và β- mercaptoethanol 1%) trong điều kiện lạnh, cho đến khi hỗn hợp trên tạo thành dịch đồng nhất.
Chuyển dịch nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml và ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 40C, tiếp tục hút dịch nổi vào một ống eppendorf khác và tiếp tục ly tâm cho đến khi được dịch trong suốt với tốc độ và thời gian như trên, thu dịch trong làm nguồn protein, bảo quản dịch protein ở -20oC cho tới khi dùng. Mỗi lần chạy điện di dùng 20 µl địch protein, phần còn lại bảo quản ở -20oC.
+ Điện di protein trên gel polyacrylamide có SDS:
Mẫu protein tách chiết được điện di trên gel polyacrylamide có SDS theo hệ thống Laemmli (1970).
Gel polyacrylamide chạy điện di gồm 2 lớp: lớp gel tách 12%T và lớp gel cô 4%T, với tỷ lệ thành phần được nêu ở bảng 2.1.
Bảng 2.2. Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS – PAGE
Thành phần Gel tách 12% Gel cô 4%
Dung dịch acrylamide 30% 1,4 ml 0,26 ml Tris – HCl 1.5M, pH 8.8 0,874 ml Tris – HCl 0.5M, pH 6.8 0,5 ml Nước cất 1,2 ml 1,23 ml APS 10% 0,0173 ml 0,01 ml SDS 10% 0,0347 ml 0,0197 ml TEMED 0,03 ml 0,01 ml
Chuẩn bị gel cô (stacking gel) có nồng độ 4%T: Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Cho các thành phần gel cô trong bảng 2.1 theo thứ tự vào ống falcon 15 ml, lắc nhẹ ống falcon vài lần
(tránh tạo bọt khí), dùng pipette loại 100 – 1000 µl bơm từ từ dung dịch gel vào khuôn, đồng thời đưa lược vào gel đề tạo các giếng mẫu ( tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel cô đã trùng ngưng hoàn toàn, cẩn thận tháo lược ra khỏi khuôn gel, tránh tạo tạo khí trong các giếng (nếu có bọt khí trong giếng, dùng pipette loại 100 – 1000 μl bơm khí mạnh vào giếng để làm vỡ bọt khí). Tiếp theo, lắp bản gel vào bộ phận điện di, cho đệm chạy vào hộp điện di.
Khi quá trình chạy điện di kết thúc, cẩn thận dùng dụng cụ chuyên dụng lấy bản gel ra. Tiến hành nhuộm bằng dung dịch nhuộm CBB-R250 đã được chuẩn bị từ trước (đổ dung dịch nhuộm vừa ngập bản gel, quá trình nhuộm được thực hiện trên máy lắc ngang mục đích nhuộm đều các băng protein). Kết thúc quá trình nhuộm khoảng 2 giờ, đổ dung dịch nhuộm đi đồng thời đổ dung dịch tẩy nhuộm vào. Tiến hành tẩy nhuộm, thời gian tẩy từ 30- 60 phút. Sau khi thấy bản gel đã được tẩy sạch, các băng xuất hiện đều, rõ nét thì quá trình tẩy nhuộm kết thúc. Đưa bản gel vừa tẩy nhuộm lên dụng cụ soi gel, tiến hành quan sát, chụp lại hình ảnh và phân tích.
+ Chạy điện di và nhuộm băng:
Bản gel được lắp vào hệ thống điện di, các buồng điện di được đổ đầy đệm Tris- glycine. Dùng micropipete loại 2 – 20 µl, hút 20 µl mẫu protein đã được tách chiết tra vào mỗi giếng gel. Sau khi tra xong, nối nguồn điện một chiều và tiến hành chạy điện di. Với hiệu điện thế ổn định 10 vol/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị bromophenol blue chạy tới khoảng cách thích hợp thì dừng lại.
Bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250, G-250 có nồng độ 0,025% pha trong acid acetid 1% và methanol 40%. Sau đó bản gel được tẩy bằng dung dịch giải nhuộm (methanol 25%, acid acetic 10%,
nước cất 65%) cho đến khi bản gel có nền sáng. Sau khi tẩy nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được tổng hợp và xử lý theo phương pháp thống kê toán học qua các thông số: giá trị trung bình mẫu, độ lêch chuẩn, sai số trung bình, tiêu chuẩn độ tin của hiệu. Tiêu chuẩn độ tin của hiệu được so trong bảng phân phối Student với mức ý nghĩa α = 0,05.
- Giá trị trung bình mẫu X : n i i x n X 1 1
n: số lượng mẫu nghiên cứu
xi: giá trị đo đếm ở mỗi lần nhắc lại
- Độ lệch chuẩn: δ = √∑𝑛𝑛=1(𝑋𝑖−X )2
𝑛−1 ( n ≤ 30) - Sai số trung bình: m = ± δ
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sự biến động hàm lượng proline của đậu tương trong quá trình gây hạn
Proline là một axit amin ưa nước, được tổng hợp từ glutamin nhờ sự xúc tác của enzyme 1 pyrroline- 5-carboxylate synthetase. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng proline là một trong những chất có vai trò điều hoà áp suất thẩm thấu ở tế bào thực vật. Hàm lượng proline trong lá và rễ của cây sống trong điều kiện khô hạn hay mô nuôi cấy trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao tăng lên nhiều lần so với cây sống trong điều kiện thường [38]. Do vậy, việc xác định hàm lượng proline trong điều kiện gây hạn được coi như là một chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu hạn của cây trồng. Do đó, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng proline trong các giống đậu tương.