thẻ chân trắng và nghiệm thức nuôi ghép tôm thẻ chân trắng với cá đối mục 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm đã được thực hiện trên các bể với thể tích 4 m3, với một nghiệm thức thí nghiệm nuôi ghép tôm thẻ chân trắng với cá đối mục và một nghiệm thức nuôi đơn tôm thẻ chân trắng, là nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.1). Có 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức, tương ứng 6 bể tổng cộng.
Trong đó, nghiệm thức 1 chỉ nuôi tôm thẻ chân trắng với mật độ 80 con/m3 tương ứng với tổng khối lượng tôm trong 1 bể ban đầu là 70,4 g. Nghiệm thức 2 nuôi tôm thẻ chân trắng (80 con/m3) thả ghép với cá đối mục (cá được thả với mật độ 10% trong lượng quần đàn tôm (khoảng 7,1 g tương ứng với 6 con cá đối mục). Kích cỡ tôm thả nuôi ban đầu 0,22 ± 0,05 g/con và cá đối mục có kích cỡ 1.2 ± 0,15 g/con.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm nuôi ghép tôm chân trắng với cá đối mục
Tôm và cá trong các nghiệm thức được nuôi ở nước biển lọc sạch ở độ mặn 15 phần ngàn, cho ăn 4 lần/ ngày (06:00, 10:00, 14:00 và 18:00 giờ), với lượng thức ăn bằng 3-10% trọng lượng thân. Sử dụng thức ăn công nghiệp (GroBest Co. Ltd. Vietnam), với hàm lượng protein trong thức ăn 35%. Sử dụng sàng ăn (nhá) để điều chỉnh lượng thức ăn. Cá nuôi trong bể thí nghiệm hoàn toàn không được cung cấp thức ăn chủ động. Bể nuôi được sục khí liên tục trong 75 ngày thí nghiệm, được xi phông và cấp thêm nước đủ bù vào lượng nước mất đi do xi phông, hàng tuần bể nuôi được thay 20% lượng nước nhằm đảm bảo duy trì chất lượng nước phù hợp với đối tượng nuôi.
3.4.2. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu chất lượng nước
Hàng tuần thu mẫu nước để kiểm tra ammoni nitrogen (NH4+-N), nitrite nitrogen (NO2–N), nitrate nitrogen (NO3–N), và tổng số phosphorous bằng máy đo multi-spectrophotometers (Hanna Model-HI83099, Rumani).
Nhiệt độ, pH ở tất cả các nghiệm thức được đo bằng các dụng cụ cầm tay, pH meter (pH/temperature Hanna Model-HI98190, Rumani) và máy đo độ mặn (Atago Model 2491-master’s, Japan), độ kiềm đo bằng bộ test CP (Thái Lan).
Nghiệm thức Mô tả chi tiết
Nghiệm thức 1 (NTĐC)
Nuôi đơn tôm thẻ chân trắng (mật độ 80 con/m3)
Nghiệm thức 2
Nuôi ghép tôm thẻ chân trắng (mật độ 80 con/m3) với cá đối mục (cá được thả với mật độ 10% trọng lượng
3.4.3. Phương pháp xác định mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn Vibrio trong nước Vibrio trong nước
3.4.3.1. Phương pháp thu mẫu nước
Mẫu nước được thu ở 4 góc và 1 điểm giữa bể, mỗi điểm thu 200 ml. Sau đó trộn đều, bảo quản ở 4oC đưa về phòng thí nghiệm phân tích.
Hình 3.4. Dụng cụ thu mẫu và môi trường nuôi cấy
3.4.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu nước
Chuẩn bị 10 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý. Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất, ta có độ pha loãng là 10 lần (10-1). Lắc đều (votex), tiếp tục lấy 1 ml nước ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống thứ hai, ta có độ pha loãng là 100 lần (10-2). Tiếp tục như vậy cho đến ống thứ n ta có độ pha loãng là 10-n.
Lấy 50µl nước nghiêng cứu ở 2-3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt, mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ 2-3 đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa thạch có cùng nồng độ pha loãng, nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch, chọn nồng độ pha loãng mà tại đó số lượng khuẩn lạc từ 20-200 khuẩn lạc/ đĩa để tính số lượng khuẩn lạc trên một mẫu.
Hình 3.5. Phương pháp pha loãng mẫu lỏng nồng độ theo dãy thập phân
3.4.3.3. Phương pháp xác định mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong nước
Dùng phương pháp gián tiếp của Kock, phương pháp này được Muroga (1987) mô tả và áp dụng trong nghiên cứu vi khuẩn của các đối tượng nuôi thủy sản.
Môi trường TSA được bổ sung 2% NaCl được dùng để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong bể nuôi, các đĩa petri chứa môi trường này được bảo quản ở nhiệt độ 4-6 oC trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy trên đĩa thạch thường một thể tích nhất định cần nghiên cứu. Sau 24h ở nhiệt độ 37oC ta đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy .
Nếu mật độ vi khuẩn trong mẫu nước quá cao, phải tiến hành pha loãng mẫu nước nuôi cấy, việc pha loãng mẫu nước sao cho số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch ≥20 và ≤200, có khả năng đếm được chính xác. Mỗi nồng độ pha loãng nên nuôi cấy từ 2-3 đĩa thạch. Số khuẩn lạc đưa vào tính toán là giá trị trung bình của các khuẩn lạc đếm được từ 2-3 đĩa thạch ở mỗi nồng độ pha loãng trên.
Tính toán số vi khuẩn tổng số có trong 1ml mẫu theo công thức: X = A / (K × V)
Trong đó:
X: là mật độ vi khuẩn (đơn vị tính cfu/ml)
A: là số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 nồng độ pha loãng (nằm trong khoảng 20-200 khuẩn lạc)
V: là thể tích nước đưa vào nuôi cấy K: là hệ số pha loãng
Hình 3.6. Đổ môi trường và pha loãng mẫu
3.4.3.4. Phương phápxác định mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước
Xác định theo phương pháp của Colwell (1984): Số lượng vi khuẩn Vibrio được xác định như phương pháp xác định vi khuẩn tổng số, và môi trường cấy cho vi khuẩn Vibrio là TCBS.
3.4.3.5. Phương pháp phát hiện thành phần vi khuẩn Vibrio trên môi trường Chrom agar
Chrom agar đã được sử dụng như môi trường đặc hiệu dành cho việc phát hiện và phân biệt các loại vi khuẩn Vibrio với các màu sắc đặc trưng. Sử dụng môi trường chrom agar cho kết quả nhanh hơn và chính xác hơn các môi trường truyền thống. lấy 50 microlite mẫu nước dàn điều lên môi trường chrom agar, mọi thao tác đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng, bọc lại bằng paraffin, ủ ở nhiệt độ 31oC trong 24 - 48h đem đếm kết quả.
3.4.3.6. Nuôi cấy thuần chủng
-Mở đĩa chứa các khuẩn lạc nghi ngờ dưới ngọn lửa đèn cồn.
-Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm từ một khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ, cấy lên đĩa thạch mới, để ở nhiệt độ 30 - 37oC, trong 24 giờ sau đó tiếp tục cấy chuyền để được vi khuẩn thuần chủng.
3.4.3.7. Kỹ thuật nhuộm Gram
-Lấy vi khuẩn dòng thuần từ môi trường thạch để nhuộm Gram theo phương pháp của Christian Gram (1884).
-Nhỏ một giọt nước lên lam kính
-Dùng que cấy đã diệt khuẩn để lấy mẫu (khuẩn lạc) đặt lên lam kính, dàn mỏng.
-Nhỏ dung dịch Violet (màu tím) lên mẫu để 30 – 60s. -Rửa nhanh bằng nước, rảy khô.
-Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút. -Rửa nhanh rảy khô.
-Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên tẩy màu. -Rửa nhanh bằng nước, rảy khô.
-Nhỏ dung dịch Fusin lên mẫu, để 1 – 2 phút.
-Rửa nước, rảy khô dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản.
Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi(vật kính dầu) nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram dương, nếu mẫu chuyển màu hồng là vi khuẩn Gram (-).
3.4.3.8. Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn Vibrio
TCBS agar được phát triển bởi kobayashi và cộng sự, sau đó Nakanishin cải tiến thành môi trường chọn lọc để phân lập vibrio spp. Đây là môi trường có tính chọn lọc cao đối với vibrio spp, được chia làm 2 nhóm lớn: nhóm không có khả năng phân giải, lên men đường sucrose sẽ sinh trưởng có khuẩn lạc màu xanh, nhóm có khả năng phân giải, lên men đường sucrose sẽ làm thay đổi pH của môit trường và sinh trưởng có khuẩn lạc màu vàng. Vì vậy, bên cạnh có khả năng mọc trên môi trường chọn lọc TCBS với hình thái khuẩn lạc điển hình, để xác định các chủng phân lập được thuộc vibrio, cần phải thử phản ứng sinh hóa. Lấy vi khuẩn dòng thuần từ môi trường thạch để test sinh hóa, định danh vi khuẩn theo khóa phân loại của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006).
Bộ định dạng trực khuẩn Gram (-) IDS14 GNR
Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn vibrio được tiến hành trên 11 phẩn ứng theo bộ phản ứng IDS14 GNR (Nam khoa, VN) bao gồm:
- Đĩa giấy Oxidase(OXI) thực hiện thử nghiệm Oxidase
- Bẳng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại giấy sinh hóa thực hiện 11 thử nghiệm sinh hóa bao gồm: lên men Glucose, khử Nitrat thành nitrit, thủy giải OPNG, sinh Urease, phenyl alanine deaminase, sử dụng citrate, thủy giải Esculin, sinh Hydrosulfite, sinh Indol, Voges-proskauer, sử dụng Malonate.
- Môi trường Lysin Decarboxylase(LDC) thực hiện thử nghiệm Lysin Decarboxylase
- Môi trường Motility (MOB) thực hiện thử nghiệm di động
- Thuốc thử sinh hóa: Nitrit, Fecl3 , kovac, k0H, α-napthtol thử nghiệm NIT,PAD, IND,VP.
Cho vào ống loại 15ml khoảng 2 ml nước muối sinh lý 0.86% nacl. Lấy từ 1-2 khuẩn lạc rời cho vào ống, votex cho đến khi tạo thành dịch huyền phù, có độ đục từ 0.5-2 thì dừng lại. lấy 200 microlit dịch huyền phù cho vào 10 giếng chứa 10 loại đĩa giây sinh hóa, cho thêm 100 microlit paraffin vào giếng số 1 và giếng số 4. Đậy nắp và ủ ở nhiệt độ 35-37 0C trong 12 – 24 h. sau 24 h lấy ra so màu và đọc kết quả.
- Phản ứng oxidase:Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của enzyme oxidase, được thực hiện qua các bước sau: Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame. Dùng kẹp vô trùng lấy một đĩa oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý,
vô trùng cho vừa đủ ước (không làm quá ước giấy oxidase) và đặt trên lame. Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa cấy oxidase. Đọc kết quả trong vòng 1 phút, đĩa giấy xuất hiện màu tím đen là (+), không đổi màu là (-)
- Thử nghiệm trên môi trường Lysin Decarboxylase (LDC): Dùng pipet lấy 50 microlit dịch huyền phù cho vào môi trường LDC sao cho đầu của pipet xuyên qua lớp paraffin lỏng phía trên. Đậy nắp và ủ ở nhiệt độ 35-37 0C, trong 12-24 h rồi quan sát sự đổi màu của môi trường, nếu môi trường không đổi màu là Gram (-), còn đổi sang màu vàng là Gram (+).
- Thử nghiệm trên môi trường di động: Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc cấy một đường thẳng đứng vào chính giữa ống nghiệm, cách đáy khoảng 1/3, rồi rút que cấy ra. đậy nắp và ủ ở 35-370C trong 12- 24 h rồi đọc kết quả. Nếu đường cấy thẳng đứng không lan ra xung quanh thì vi khuẩn không di động và ngược lại.
3.4.4. Phương pháp thu mẫu, phân tích Nitơ và Phốt pho
Mẫu thức ăn sử dụng trong thí nghiệm của công ty Growbest được thu 200 gam. Mẫu tôm chân trắng và cá đối mục được thu ở 2 giai đoạn: giai đoạn bắt đầu thí nghiệm 200g/mẫu/nghiệm thức và giai đoạn kết thúc thí nghiệm 200g/mẫu/nghiệm thức. Hàm lượng tổng Nitơ (%) trong thức ăn, tôm chân trắng, cá đối mục được sấy khô ở nhiệt độ 600C, tính khối lượng và sau đó phân tích bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000; FOSS Tecator AB, 2001). Hàm lượng Phốt pho được phân tích theo phương pháp thông dụng (AOAC 1984). Các mẫu được gửi đi phân tích tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phầm, thực phẩm, Sở y tế Thừa Thiên Huế.
3.4.5. Phương pháp tính toán cân bằng dinh dưỡng
Dòng chảy dinh dưỡng ở các nghiệm thức được tính toán dựa theo công thức của Funge-Smith và cộng sự, 1996 [46].
Sin + Fin + Fertin+ TVin + WEin= Sout + Fout + TVout + WEout + UN
Trong đó: S: Tôm, F: Thức ăn, Fert: Phân bón, TV: Thể tích nước của bể, WE: Trao đổi nước, UN: Dinh dưỡng không tính được.
3.4.6. Phương pháp tính tăng trưởng về trọng lượng và chiều dài
3.4.6.1. Chỉtiêu tăng trưởng về trọng lượng
Phương pháp xác định:
Định kỳ 15 ngày kiểm tra một lần bằng cách dùng vợt để thu mẫu ngẫu nhiên. Xác định trọng lượng bằng cân đồng hồ với độ chính xác đến 0,1gam.
Công thức tính:
Tốc độ tăng trưởng theo ngày về khối lượng (g/ngày) = WTB1: Khối lượng tại thời điểm T1
WTB2: Khối lượng tại thời điểm T2
T1, T2: Lần lượt là các thời điểm của các lần cân (được tính theo ngày).
3.4.6.2. Chỉtiêu tăng trưởng về chiều dài
Định kỳ 15 ngày kiểm tra một lần bằng cách dùng vợt để thu mẫu ngẫu nhiên. Đo bằng thước kẻ 30 cm với độ chính xác 0,1 cm. Đo tôm từ chủy đầu đến cuối telson khi cơ thể nằm trên 1 đường thẳng.
Công thức tính:
Tốc độ tăng trưởng theo ngày về chiều dài (cm/ngày) = LTB1: Chiều dài trung bình tại thời điểm T1
LTB2: Chiều dài trung bình tại thời điểm T2
T1, T2: Lần lượt là các thời điểm của các lần đo (thường được tính theo tuần hoặc ngày).
3.4.7. Xác định hệ số chuyển đổi thức ăn
Xác định hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR: Feed Conversion Ratio) của 2 nghiệm thức theo công thức:
Tổng lượng thức ăn tiêu tốn FCR =
Tổng khối lượng tôm thu hoạch
3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thống kê được thu thập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2017 và SPSS 20.0. Các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được xử lý trên chương trình Microfl Excel 2017. So sánh các giá trị trung bình giữa các nghiệm thức dựa vào phép phân tích T-test với mức ý nghĩa (p< 0,05) bằng phần mềm SPPS 20.0.
WTB2-WTB1
T2-T1
LTB2 - LTB1 T2-T1
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. KẾT QUẢ THEO DÕI CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG
Động vật thủy sản sống trong nước nên các hoạt động sống của chúng phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố môi trường nước. Sự thay đổi các yếu tố môi trường sống sẽ ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên sự sinh trưởng và phát triển của các sinh vật sống trong đó. Các yếu tố môi trường thay đổi quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tôm thẻ chân trắng. Nhiệt độ, pH, độ mặn, độ kiềm, chất rắn lơ lững, phốt pho, TAN, NO2-N, NO3-N là những yếu tố có tác động trực tiếp đến đời sống của tôm, đây là những chỉ số môi trường thường biến động, tùy thuộc vào sự biến đổi của thời tiết, chế độ chăm sóc quản lý. Sự thay đổi của chúng có thể gây bất lợi cho tôm nuôi. Trong quá trình thực hiện đề tài, các yếu tố môi trường được kiểm tra thường xuyên và duy trì tương đối đồng nhất giữa các bể thí nghiệm. Kết quả theo dõi biến động các yếu tố môi trường được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Các yếu tố môi trường trong các nghiệm thức
Yếu tố môi trường
Nghiệm thức
Nuôi đơn Nuôi ghép
Nhiệt độ (0C) 28,4 – 31,00 29,66a ± 0,014 28,3 – 31,00 29,65a ± 0,014 pH 7,30 – 7,55 7,41a ± 0,006 7,30 – 7,56 7,41a ± 0,006 Độ kiềm (mg/l) 85,00 – 95,00 88,30a ± 0,73 85,00 – 95,00 89,0a ± 0,299 TAN (mg/l) 0,25 – 0,65 0,48a ± 0,01 0,25 – 0,61 0,45a ± 0,01 NO2- (mg/l) 0,01 – 0,05 0,03a ± 0,00 0,01 – 0,05 0,03a ± 0,001 NO3- (mg/l) 6,12 – 12,60 9,54a ± 0,04 6,20 – 11,86 9,37a ± 0,13 Phốt pho (mg/l) 0,10 – 1,00 0,79a ± 0,00 0,10 – 0,95 0,76a ± 0,002 TSS 23,50 – 57,00 43,80a ± 1,12 22,50 – 50,20 38,83b ± 0,41
4.1.1. Diễn biến yếu tố nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng trực tiếp tới sự hô hấp, tiêu thụ thức ăn, đồng hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng và tỷ lệ sống [9].
Bảng 4.1 cho thấy, trong thời gian tiến hành thí nghiệm nhiệt độ trung bình ở các bể thí nghiệm là 29,66 NT1 và 29,65oC ở NT2. Do thí nghiệm được bố trí trong nhà, vào thời điểm tháng 5 đến tháng 8, nhiệt độ dao động không lớn, khoảng giá trị dao động thấp nhất (28,3 – 31,00oC) ở NT2, và khoảng dao động (28,4 – 31,000C) ở NT1.
Theo kết quả nghiên cứu của Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lư (2011) thì tôm thẻ chân trắng sinh trưởng, phát triển và tỷ lệ sống đạt kết quả cao nhất trong điều kiện