L ỜI CẢM ƠN
2.5.7. Phương pháp ELISA gián tiếp
2.5.7.1. Pha hóa chất cho phản ứng ELISA
Pha PBS 1X: 800ml nước cất + 8g NaCl + 0,2g KCl + 1,44g Na2HPO4 + 0,24g KH2PO4, khuấy đều rồi điều chỉnh đến pH 7.4. Cho thêm nước cất vào đến
đủ 1 lít.
Pha BSA 1%: 0,5g BSA + 50ml PBS 1X, pH 7.2.
Pha Coating buffer: 1 viên Coating buffer + 100ml nước cất.
Pha Wash ELISA: 990ml nước cất + 10ml PBS 10X + 500 µl Tween 20. Pha kháng thể 2: 10µl Anti-Pig IgG + 10ml BSA.
Pha Đệm pha cơ chất OPD: 1 viên Phosphate-Citrate Buffer + 100ml PBS 1X.
2.5.7.2. Các bước thực hiện ELISA
Chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp đểxác địnhlượng kháng thể
trong huyết thanh động vật thí nghiệm qua các bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị kháng nguyên FHH phủđĩa sao cho nồng độ cuối cùng đạt 5 µg/ml/loại kháng nguyên.
Bước 2: Cho vào mỗi giếng 100 μl kháng nguyên đã pha với dung dịch
Coating buffer.
Bước 3: Đậy khay lại và ủ 2 giờở nhiệt độ phòng hoặc ủqua đêm ở 4oC.
Bước 4: Đổ thành phần thừa của phản ứng, sau đó rửa các giếng 3 lần bằng 200 μl dung dịch rửa.
Bước 5: Thêm 200 μl dung dịch Blocking vào mỗi giếng, đậy khay lại và ủ 2
giờởnhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC.
Bước 6: Rửa các giếng 3 lần bằng 200 μl dung dịch rửa.
Bước 7: Cho 100 μl huyết thanh lợn/sữa đẫu đã pha loãng 100 lần với dung dịch blocking vào mỗi giếng.
Bước 8: Đậy khay và ủ 1 giờ.
Bước 9: Rửa giếng 6 lần với dung dịch rửa.
Bước 10: Cho 100 μl kháng thể 2 (Anti-Pig IgG) đã pha loãng (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) với dung dịch blocking vào mỗi giếng, ủ trong 1 giờ.
Bước 11: Rửa khay 6 lần với dung dịch rửa.
Bước 12: Cho 100 μl cơ chất (OPD) vào mỗi giếng, ủ trong 15 phút. Bước 13: Đọc kết quả ởbước sóng 450 nm.
Mẫu dương tính khi giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off). Giá trị giới hạn = trung bình OD của nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng) (Classen và cs, 1987).