Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 11 mồi RAPD (UBC#301, UBC#312, UBC#322, UBC#334, UBC#337, UBC#350, UBC#353, UBC#357, UBC#368, UBC#381 và UBC#386) cho sản phẩm điện di rõ và được chọn để phân tích mối quan hệ di truyền của 48 giống mướp hương.
Sản phẩm PCR với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1% để phân tích đa hình DNA của 48 giống mướp hương. Các phân đoạn DNA thu được sau khi điện di được chúng tôi thống kê, nếu xuất hiện băng DNA thì kí hiệu 1, nếu không xuất hiện thì kí hiệu là 0. Dữ liệu được xử lí bằng phần mềm NTSYS pc version 2.0 để xác định mức độ đa hình di truyền của 48 giống mướp hương nghiên cứu. Những phân đoạn mà có ở giống này nhưng không có ở giống khác gọi là phân đoạn đa hình. Dựa
vào mức độ đa hình của các phân đoạn này chúng ta có thể đánh giá mức độ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu mướp hương nghiên cứu.
Điện di sản phẩm RAPD với 11 mồi nghiên cứu ở 48 giống mướp hương kết quả cho thấy, số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 56 đến 513 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 200 bp đến 1500 bp.
Tổng số phân đoạn DNA nhân bản sử dụng 11 mồi RAPD phân tích 48 giống mướp hương là 3265 phân đoạn. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.7.
Từ Bảng 3.7 cho thấy, trong số 11 mồi phân tích, thì mồi UBC#353 cho số phân đoạn DNA được nhân bản là nhiều nhất (513 phân đoạn DNA) với kích thước quan sát từ 260 bp -1200 bp và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi UBC#386 (56 phân đoạn DNA) với kích thước quan sát từ 280 bp – 1000 bp.
Đối với từng giống thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau. Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản của 48 giống mướp hương dao động từ 46 phân đoạn đến 85 phân đoạn.
Từ phân tích Bảng 3.7 cho thấy, giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 11 mồi nhiều nhất là giống B24 (85 phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 11 mồi ít nhất là giống A2 (46 phân đoạn).
Bảng 3.7 Tổng số băng DNA khuếch đại của 48 giống mướp hương khi phân tích với 11 mồi RAPD
Mồi Giống UBC# 301 UBC# 312 UBC# 322 UBC# 334 UBC# 337 UBC# 350 UBC# 353 UBC# 357 UBC# 368 UBC# 381 UBC# 386 Tổng số đoạn DNA khuếch đại A1 9 9 7 0 6 10 13 5 0 4 2 65 A2 9 10 4 1 4 7 1 0 1 7 2 46 A3 8 8 8 0 6 12 13 8 5 7 2 77 A4 7 11 6 3 9 13 14 7 3 9 1 83 A5 10 10 7 3 5 11 12 7 3 7 2 77 A6 10 10 5 3 5 11 12 1 3 6 2 68 A7 8 7 4 0 3 10 11 0 1 4 1 49 A10 8 9 5 2 4 10 10 0 5 9 2 64 A11 9 9 4 2 4 8 12 7 1 8 2 66 A12 6 9 6 3 4 7 12 7 6 6 2 68 A13 8 9 6 0 6 10 10 3 0 8 2 62 A15 6 8 8 3 4 9 11 10 7 7 2 75 A16 9 9 5 2 5 9 12 0 6 5 2 64 A17 7 9 7 0 5 11 11 3 1 9 2 65 A18 7 7 8 1 5 10 14 5 6 7 2 72 A19 8 10 10 3 4 6 12 0 8 6 2 69 A20 6 10 8 0 4 6 11 0 7 6 0 58 A29 7 11 9 2 4 9 11 0 5 6 2 66 A30 8 10 7 3 5 3 12 10 5 5 2 70 B1 9 4 8 0 4 6 11 14 7 6 2 71 B2 9 10 10 3 5 8 12 9 7 7 1 81 B3 8 10 0 1 5 14 12 6 6 9 2 73 B4 8 9 10 3 5 3 11 0 6 8 0 63 B5 7 11 5 3 5 6 11 11 7 7 1 74 B6 7 10 5 3 4 6 11 8 6 7 1 68 B7 8 8 5 2 4 9 0 0 5 8 2 51 B8 7 7 6 3 4 5 11 10 5 6 0 64 B9 7 8 3 0 6 7 11 1 7 7 0 57 B10 8 11 5 1 5 6 12 0 1 9 2 60 B12 7 10 5 3 5 5 12 0 7 7 0 61
Mồi Giống UBC# 301 UBC# 312 UBC# 322 UBC# 334 UBC# 337 UBC# 350 UBC# 353 UBC# 357 UBC# 368 UBC# 381 UBC# 386 Tổng số đoạn DNA khuếch đại B13 7 9 5 2 5 11 12 5 7 5 1 69 B14 7 9 6 1 5 11 14 0 10 7 1 71 B15 7 10 6 3 5 9 12 10 6 7 0 75 B16 8 10 7 3 5 8 10 4 6 7 2 70 B17 9 11 7 4 6 4 10 0 8 8 0 66 B18 9 9 4 2 5 13 0 10 7 9 0 68 B19 9 9 7 2 5 10 11 7 8 6 0 74 B21 9 10 6 1 5 12 8 7 1 7 0 66 B22 10 10 8 3 4 11 12 8 3 8 2 79 B23 11 11 9 3 5 12 13 0 7 7 0 78 B24 10 10 4 3 5 11 12 10 10 9 1 85 B25 8 10 6 2 4 14 11 10 8 7 0 80 B26 10 13 5 4 6 9 10 0 8 8 0 72 B27 8 11 4 1 4 10 9 8 5 8 0 68 B28 9 9 5 3 5 9 11 0 8 8 0 67 B29 8 10 5 0 4 13 8 1 0 3 0 52 B30 9 10 4 1 5 6 12 0 6 13 2 68 ĐP 9 10 0 3 6 11 10 9 0 8 2 68 Tổng 392 454 284 94 233 431 513 221 245 342 56 3265
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các giống mướp hương với nhau trong cùng 1 mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu. Kết quả tổng hợp ở Bảng 3.8.
Qua phân tích Bảng 3.8 nhận thấy, tổng số phân đoạn DNA của 11 giống mướp hương khi phân tích 11 mồi ngẫu nhiên là 111 phân đoạn, trong đó có 63 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 56,76%) và không đa hình là 48 phân đoạn (chiếm 43,24%). Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 200 bp đến 1500 bp. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 2 đến 14 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi UBC#386 (2 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi UBC#350, UBC#353 và UBC#357 (14 phân đoạn).
Bảng 3.8 Tỷ lệ đa hình của tập đoàn giống mướp hương với chỉ thị RAPD
Mồi Số phân đoạn
DNA
Số phân đoạn
đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%)
UBC#301 11 4 7 36,36 UBC#312 13 6 7 46,15 UBC#322 10 8 2 80 UBC#334 4 4 0 100 UBC#337 9 5 4 55,56 UBC#350 14 8 6 57,14 UBC#353 14 5 6 35,71 UBC#357 14 6 8 42,86 UBC#368 10 8 2 80 UBC#381 13 8 5 61,54 UBC#386 2 1 1 50 Tổng 111 63 48 56,76
Bảng 3.8 cũng cho thấy, cả 11 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mức độ đa hình của 11 mồi nghiên cứu dao động từ 35,71% đến 100%. Mồi biểu hiện tính đa hình thấp nhất đó là mồi UBC#353 (35,71%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi UBC#334 (100%), sau đó là mồi UBC#322 và UBC#368 với tỷ lệ đa hình chiếm 80%.
Kết quả điện di kiểm tra phản ứng RAPD trên gel agarose 1% của 11 mồi được chúng tôi phân tích chi tiết thông qua các ảnh điện di được trình bày dưới đây:
Mồi UBC#301
Kết quả diện di sản phẩm PCR của 48 giống mướp hương nghiên cứu với mồi UBC#301 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên dao động trong khoảng 6 đến 10 phân đoạn. Các phân đoạn xuất hiện ở 14 vị trí khác nhau trên ảnh điện di. Kích thước các phân đoạn dao động 180 bp – 730 bp.
Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của tập đoàn giống mướp hương sử dụng mồi UBC#301.
Ghi chú: M: 100 bp DNA ladder
Trong đó, giống A5, A6, B22 và B24 có số phân đoạn là 10, các giống còn lại có 6 đến 9 phân đoạn được nhân bản. Tại vị trí 250 bp xuất hiện phân đoạn DNA ở giống A16, A1, A5, A7, A13, A19, A20, A29, A30, B1, B2, B4, B15, B17, B24, B26 và B29. Tại vị trí 500 bp không xuất hiện phân đoạn DNA ở giống A16, A3, A4, A15, A18, B5, B6, B13, và B24, đều xuất hiện số phân đoạn ở các giống còn lại . Tại vị trí
670 bp không xuất hiện phân đoạn DNA ở giống B30, A1, A2, A3, A7, A12, A15, A18, A19, A20, A29, A30, B4, B13 và B29. Tại vị trí 730 bp có A3, A4, A11, A18, B24 và B26 xuất hiện phân đoạn DNA, còn lại đều không xuất hiện số phân đoạn ở các giống còn lại. Vậy trong số 10 phân đoạn DNA xuất hiện 4 phân đoạn biểu hiện tính đa hình.
Như vậy, với mồi UBC#301 tổng số có 392 phân đoạn được nhân bản ở 48 giống mướp hương và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA giữa các giống mướp hương tại 4 vị trí 250 bp, 500 bp, 670 bp và 730 bp.
Mồi UBC#312
Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi UBC#312 được thể hiện ở hình 3.5 Hình 3.5 cho thấy, đã có từ 1 - 7 phân đoạn DNA được nhân bản. Các phân đoạn này có chiều dài ước tính từ 300-1300 bp. Giống xuất hiện nhiều phân đoạn DNA nhất là giống B26 (13 phân đoạn). Giống B1 có số phân đoạn DNA ít nhất (4 phân đoạn).
Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm phẩm PCR của tập đoàn giống mướp hương sử dụng mồi UBC#312
Ghi chú: M: 100 bp DNA ladder
Với mồi UBC#312 có 6 phân đoạn biểu hiện tính đa hình tương ứng với kích thước 530 bp, 600 bp, 700 bp, 900 bp, 1200 bp và 1300 bp. Ở kích thước 530 bp có 15 giống B10, A4, A29, B2, B4, B5, B9, B12, B17, B18, B19, B24, B26, B27, B28 và B29 xuất hiện phân đoạn DNA. Ở vị trí 600 bp có giống A5, A6, A7 A12, A13, B2,
B5, B18, B19, B21 và B22 xuất hiện phân đoạn DNA, không xuất hiện số phân đoạn ở các giống còn lại. Ở vị trí 700 bp có giống B10, A16, ĐP, A2, A4, A20, A30, B5, B6, B12, B23, B24 và B26 xuất hiện phân đoạn DNA. Ở vị trí 900 bp có chỉ 8 giống B1, B7, B8, B9, B12, B13, B18 và B19 không xuất hiện phân đoạn DNA, còn lại các giống đều xuất hiện. Còn ở vị trí 1200 bp có 4 giống xuất hiện số phân đoạn DNA trong tổng số 48 giống mướp hương nghiên cứu, đó là các giống A16, B1, B21 và B24. Có 9 giống xuất hiện số phân đoạn DNA ở vị trí 1300 bp là A7, A29, B8, B9, B12, B19, B22, B28 và B29. Như vậy, với mồi UBC#312 có 6 phân đoạn DNA thể hiện tính đa hình.
Mồi UBC#322
Kết quả điện di sản phẩm PCR từ hệ gen của 48 giống mướp hương với mồi UBC#322 được thể hiện ở Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi UBC#322 có 10 phân đoạn DNA được nhân bản và cả 8 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình.
Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm phẩm PCR của một số giống mướp hương sử dụng mồi UBC#322
Ghi chú: M: 100 bp DNA ladder
Giống A19, B2 và B4 có số phân đoạn DNA nhân bản nhiều nhất với 10 phân đoạn. Giống B9 có số phân đoạn DNA ít nhất là 3 phân đoạn. Tại vị trí kích thước 200 bp có 12 giống là A15, A17, A18, A19, A29, A30, B1, B2, B4, B17, B23 và B25 xuất hiện phân đoạn DNA, trong khi đó ở các giống khác không xuất hiện phân đoạn này. Tại vị trí 260 bp giống A3, A15, A17, A18, A19, A20, A29, A30, B1, B2, B4. B8, B12, B17, B19, B22 và B23 xuất hiện phân đoạn DNA. Tại vị trí 300 bp có chỉ 5 giống xuất hiện phân đoạn DNA đó là giống A1, A3, A13, A29 và B4. Ngược lại, tại vị trí 400 bp có 10 giống không xuất hiện phân đoạn DNA đó là giống A16, A2, A3,
A4, A10, A11, A13, B6, B7 và B19, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn DNA. Tiếp theo, tại vị trí 550 bp không có sự xuất hiện phân đoạn DNA ở các giống B30, A16, A2, A7, A10, A11, A12, A13, A17, A18, A20, A29, A30, B5, B8, B9, B16, B17, B18, B19, B25 và B29. Các giống A6, A7, B9, B14, B18, B24 và B27 không xuất hiện số phân đoạn ở vị trí 940 bp các giống còn lại thì đều xuất hiện số phân đoạn DNA. Tại vị trí 1100 bp có 11 giống B30, A16, A10, A12, A30, B1, B6, B16, B21, B22 và B23 xuất hiện số phân đoạn DNA các giống còn lại không xuất hiện. Cuối cùng là ở vị trí 1200 bp có 5 giống không xuất hiện số phân đoạn DNA là B30, B5, B7, B9 và B27 và 43 giống còn lại xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí này. Như vậy, với mồi UBC#322, các phân đoạn thể hiện tính đa hình ở 8 vị trí khác nhau (200 bp, 260 bp, 300 bp, 400 bp, 550 bp, 940 bp, 1100 bp, và 1200 bp).
Mồi UBC#334
Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR của 48 giống mướp hương với mồi UBC#334 xuất hiện từ 4 phân đoạn DNA được nhân bản và cả 4 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình, chúng có chiều dài ước tính từ 600 – 1000 bp.
Mồi UBC#337
Đây là mồi điển hình trong số 11 mồi cho tính đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản. Tổng số phân đoạn được nhân bản với 48 giống mướp hương thu được 233 phân đoạn DNA tương ứng với 9 băng khi kiểm tra trên gel agarose 1%. Ảnh điện di được tổng hợp và thể hiện trên Hình 3.7
Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của tập đoàn giống mướp hương sử dụng mồi UBC#337.
Ghi chú: M: 100 bp DNA ladder
Cụ thể ở kích thước khoảng 200 bp có 13 giống B10, A4, A11, A17, B4, B5, B8, B15, B16, B17, B23, B24 và B26 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản, 35 mẫu còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 250 bp có 5 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản là A3, A4, A18, B16, và B26, các mẫu còn lại đều không thấy xuất hiện. Ở vị trí 360 bp có 23 giống không xuất hiện số phân đoạn DNA là A2, A4, A7, A10, A11, A12, A15, A17, A18, A19, A20, A29, B1, B2, B6, B7, B8, B22, B23, B24, B25, B26 và B27. Có 6 giống A1, A13, A17, A18, B24 và B26 xuất hiện số phân đoạn DNA, còn 42 giống còn lại không thu được phân đoạn DNA ở kích thước khoảng 590
bp. Ở kích thước khoảng 950 bp có 9 mẫu thu được phân đoạn DNA nhân bản, đó là các giống ĐP, B2, B6, B9, B12, B23, B24, B25 và B27.
Mồi UBC#350
Kết quả điện di sản phẩm PCR của mồi UBC#350 được thể hiện ở Hình 3.8. Hình 3.8 cho thấy, trong phạm vi vùng phân tích từ 300 – 1000 bp có 14 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 8 phân đoạn cho tính đa hình. Cụ thể ở kích thước khoảng 450 bp, chỉ có 11 giống B30, A4, A10, A12, B13, B15, B18, B22, B24, B25 và B27 nhân được phân đoạn DNA. Ở kích thước khoảng 500 bp cũng có 19 giống B10, A3, A4, A11, A12, A17, A18, A19, A20, A30, B1, B4, B5, B6, B12, B17, B18, B19 và B22 không xuất hiên phân đoạn DNA. Và ở 550 bp cũng có 19 giống B10, B30, A16, A11, A12, A18, A20, A29, A30, B1, B6, B7, B8, B9, B12, B17, B24, B27 và B28 không nhân được phân đoạn DNA. Còn ở vị trí khoảng 650 bp có 18 không xuất hiện số phân đoạn DNA trong tổng số 48 giống mướp hương nghiên cứu, đó là các giống B10, A12, A15, A19, A20, A29, A30, B2, B4, B5, B6, B7, B8, B12, B17, B18, B19 và B22. Có 19 giống xuất hiện số phân đoạn DNA ở vị trí 890 bp là B10, A16, A1, A2, A4, A5, A6, A7, A11, A12, A15, A20, A30, B1, B6, B12, B26, B27 và B29. Tại ví trí 900 bp có giống A2, A4, A5, A6, A12, A20, A29, A30, B1, B2, B4, B5, B6, B8, B9, B12, B15, B16, B17, B19, B23, B24, B26, B27 và B29 không xuất hiện phân đoạn DNA, còn lại các giống đều xuất hiện. Ở kích thước khoảng 1350 bp có 11 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản là A3, A18, A29, B5, B9, B14, B18, B19, B21, B23 và B28, các mẫu giống còn lại đều không thấy xuất hiện. Cuối cùng tại vị trí kích thước khoảng 1500 bp có 19 là B3, B10, A1, A4, A7, A13, A15, A19, A20, A30, B1, B4, B6, B8, B12, B13, B15, B17 và B29 không xuất hiện số phân đoạn DNA còn các giống khác đều xuất hiện phân đoạn này.
Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của tập đoàn giống mướp hương sử dụng mồi UBC#350
Ghi chú: M: 100 bp DNA ladder
Mồi UBC#353
Từ Hình 3.9 ta thấy, kết quả điện di sản phẩm PCR của 48 giống mướp hương