Kỹ thuật RAPD hiện nay đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật như đậu tương [16], lúa [21], khoai tây [27],... Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử [54], [55].
Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [15].
Đinh Thi Phong và cs (2008) đã sử dụng 19 giống đậu tương từ tập đoàn giống đậu tương của Viện Nghiên cứu dầu và Cây cọ dầu Việt Nam đã được nghiên cứu khoảng cách di truyền để xác định vật liệu trong chọn tạo giống mới. Các tác giả đã sử dụng 25 mồi RAPD có tính đa hình [19].
Phạm Đức Toàn và cs (2009) sử dụng 10 mồi RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mè (Sesamum indicum L.) ở Việt Nam và Campuchia, tạo ra 107 sản phẩm khếch đại, trong đó có 88 phân đoạn da hình (83%) [70].
Nguyễn Minh Quế (2009) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để đánh giá mối quan hệ di truyền của 5 giống dẻ bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạn được nhân bản ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong đó có 14 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 30,4%) và không cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm 69,9%) [20].
Hoàng Thị Thao (2010) bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 1208 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 30 giống đậu xanh. Trong 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng thì cả 10 mồi biểu hiện tính đa hình. Kết quả phân tích cho thấy, 30 giống đậu xanh nghiên cứu chia thành 2 nhóm chính, hệ số tương đồng di truyền giữa 2 nhóm là 67% (tức sai khác 33%) [25].
Đinh Ngọc Hương (2011) xác định được các phân đoạn DNA được nhân bản trong phản ứng RAPD với 16/25 mồi, trong đó có 9/16 mồi thể hiện tính đa hình cao và hàm lượng thồng tin đa hình có giá trị PIC > 0,5. Số phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi mồi dao động từ 2 - 8 và tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 16 mồi ở cả 30 giống đậu tương là 1388 [11].
Paulo (2004), xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu được 225 băng, trong đó có 184 băng thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%). Từ kết quả này, cây phả hệ được thành lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMA. Kết quả nghiên cứu này sẽ được sử dụng để chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngô [59].
Dey và cs (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 38 dòng lúa thơm và 2 dòng đối chứng. Nhóm tác giả đã tiến hành phản ứng RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên. Kết quả khuếch đại được 44 băng DNA, với kích thước từ 500 - 3500 bp. Trong 44 băng có 41 băng thể hiện tính đa hình [40].
Subramanian và cs (2006), đã nghiên cứu tính đa hình DNA ở cây lạc nhờ kỹ thuật RAPD. Nhóm tác giả đã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác định được 7 mồi (14,6%) đa hình. Tổng số băng DNA được tạo ra từ 7 mồi đó là 408 băng, trong đó có 27 băng thể hiện tính đa hình [69].
Awan (2007), sử dụng kỹ thuật RAPD để xác định mối quan hệ di truyền của 7 giống lúa mì ở Pakistan (6 giống nhập nội và 1 giống khác). Kết quả có 112 băng DNA được tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên, trong đó có 50 băng thể hiện tính đa hình, mối tương đồng di truyền là 86,2 - 93%. Điều này cho biết mối quan hệ gần gũi của các giống lúa mì này [33].
Neha và cs (2010) phân tích sử đa dạng di truyền của 17 giống hạt đậu pigeon bằng kỹ thuật RAPD thu được 198 băng DNA trong đó có 148 băng DNA đa hình (74,7 %). Chín trong mười tám mồi cho hơn 80% đa hình, hệ số tương đồng dao động từ 0,272 đến 0,778 [56].
Souza và cs (2011) sử dụng chỉ thị RAPD phân tích sự đa dạng di truyền của xoài (Mangiera indica) giống cây ở Brazil, trong đó có 35 giống có nguồn gốc trồng tại Brazil, Mỹ và một từ Ấn Độ. DNA di truyền, được chiết xuất từ vật liệu lá non, bằng cách sử dụng một bộ lọc thương mại, được PCR sử dụng mồi A01, A09, G03, G10, N05, và M16. 55 locus đa hình đã được xác định, với trung bình 9,16 ± 3,31 băng với mỗi mồi và đa hình 100%[68].
Chỉ thị RAPD cũng được sử dụng kết hợp với các chỉ thị RFLP , SSR,... để xây dựng bản đồ di truyền liên kết ở các loài như: đậu nành, ngô, lạc...
Raina và cs (2001), đã sử dụng chỉ thị RAPD - SSR để phân tích sự đa dạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [61].
Antonio và cs (2004), đã kết hợp các kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 dòng ngô lai. Sử dụng kỹ thuật AFLP thu được 774 băng đa hình, kỹ thuật RAPD khuếch đại được 262 băng DNA, kỹ thuật RFLP thu được 185 băng và SSR nhận được 68 băng đa hình [31].
Nguyễn Thi Lang va cs (2007), đã sử dụng 30 giống đậu nành từ ngân hàng gene của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long để nghiên cứu, đánh giá đa dạng nguồn gene bằng chỉ thị RAPD và SSR. Thông qua các dữ liệu chỉ thị RAPD với 9 mồi được sử dụng, 30 giống được phân thành 4 nhóm chính. Trong phân nhóm của SSR trên 6 chỉ thị, được ghi nhận với 3 nhóm khác biệt. Sơ đồ phân nhóm hình cây phối hợp hai phương pháp chỉ thị phân tử được thiết lập với 3 nhóm khác nhau. Chỉ số đa dạng phân tích theo phương pháp SSR cao (H = 0,312) trong khi chỉ số đa dạng của RAPD chỉ thị phân tử rất thấp (H = 0,124). Cả 2 phương pháp cho sự tương quan trong nhóm rất cao với biến động từ 0,59 cho chỉ thị SSR và 0,77 cho chỉ thị RAPD [14].
Venkata và cs (2007) đã xác định tính đa hình DNA ở 21 giống chuối ở Nam Ấn Độ nhờ chỉ thị RAPD và ISSR. Phản ứng RAPD được thực hiện với 50 mồi và ISSR với 12 mồi. Kết quả thu được 641 băng DNA, có kích thước 200 - 3100 bp, trong đó có 382 băng thể hiện tính đa hình, tương ứng với 60% tính đa dạng sinh học [71].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên, trong đó có 18 mồi thể hiện tính đa hình và kỹ thuật SSR với 10 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau. Kết quả nhận được 79 phân đoạn DNA với 18 mồi RAPD và 91 phân đoạn với
10 mồi SSR. Từ đó thiết lập biểu đồ hình cây xác định quan hệ di truyền của các giống đậu xanh [24].
Muthusamy và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật ISSR với 37 cặp mồi để nghiên cứu quan hệ di truyền của 10 giống đậu gạo thu được 987 băng DNA (trong đó có 719 băng đa hình) từ kỹ thuật RAPD và 479 băng DNA (trong đó có 296 băng đa hình) từ kỹ thuật ISSR, mức độ đa hình RAPD là 70,3 %, mức độ đa hình ISSR là 60,79 % [53].
Leal va cs (2010) sử dụng chỉ thị RAPD và SSR để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng bắp rang. Với 9 mồi RAPD thu được 126 băng DNA, trong đó có 104 băng đa hình. Với SSR, số alen mỗi locus dao động từ 2 đến 5 alen, tổng số alen thu được là 47 alen. Khi so sánh các nhóm được hình thành bằng chỉ thị SSR và chỉ thị RAPD, có những điểm tương đồng trong các kết hợp của các kiểu gene từ cùng một phả hệ. Hệ số tương quan có được thông qua chỉ thị SSR và RAPD là tương đối cao (0,55), cho thấy cả hai kỹ thuật này có hiệu quả để đánh giá đa dạng di truyền [51].
Saleh (2012) sử dụng các kỹ thuật NIR, RAPD và AFLP để đánh giá các thành phần hóa học và biến đổi di truyền của các giống lúa mì Syria [65].
Kawar và cs (2009) [57] đã phân tích đa dạng di truyền của 18 giống mía bằng kỹ thuật RAPD với 40 mồi ngẫu nhiên đã thu được 134 băng, trong đó 44,9% là băng đa hình. Hệ số tương quan di truyền của các giống mía dao động từ 0,77 - 0,99.
Sajidabibi và cs (2009) [64] sử dụng 14 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu về đa dạng di truyền của 20 giống lúa mì. Kết quả phân tích sản phẩm RAPD đã khuếch đại được 102 băng, trong đó có 91 băng đa hình (chiếm 89,2%) và chỉ có 11 băng đơn hình (chiếm 10,8%).
Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền.
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống mướp hương ở mức kiểu hình và mức phân tử DNA
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Đánh giá được đặc điểm hình thái, năng suất và chất lượng quả của tập đoàn mướp hương.
- Chọn được các chỉ thỉ RAPD biểu hiện đa hình về kiểu gen của một số giống mướp hương đại diện.
- Đánh giá được kiểu gen của tập đoàn mướp hương với các chỉ thị đa hình RAPD.
- Xác định được sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của tập đoàn giống mướp hương bằng kỹ thuật RAPD.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát kiểu hình của tập đoàn giống mướp hương thông qua các đặc điểm hình thái, năng suất và phẩm chất quả.
- Khảo khát tính đa hình của chỉ thị phân tử RAPD trên một số giống mướp hương đại diện từ tập đoàn giống.
- Sử dụng các mồi biểu hiện đa hình RAPD để đánh giá kiểu gen của tập đoàn giống mướp hương.
- Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các giống mướp hương nghiên cứu.
2.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
* Giống: Chúng tôi tiến hành đánh giá quan hệ di truyền của 48 giống mướp hương (Bảng 1), trong đó 47 giống được thu thập từ trung tâm Tài nguyên Thực vật - Viện Khoa học Việt Nam và 1 giống mướp hương địa phương được thu thập tại Gia Lâm - Hà Nội.
Bảng 2.1. Danh sách tập đoàn giống mướp hương nghiên cứu.
STT KH giống SĐK Tên giống STT KH giống SĐK Tên giống
1 A1 GBVN007760 Mướp Thơm quả dài 25 B6 GBVN005326 Mướp Thơm
2 A2 GBVN007766 Mướp hương 26 B7 GBVN005331 Mướp hương dạng 1
3 A3 GBVN007767 Mướp hương dạng 1 27 B8 GBVN005332 Mướp Tràng Định
4 A4 GBVN007768 Mướp hương 28 B9 GBVN005333 Mướp hương
5 A5 GBVN007769 Mướp Thơm 29 B10 GBVN005336 Mướp hương
6 A6 GBVN007773 Mướp hương 30 B12 GBVN005346 Mướp hương dạng 1
7 A7 GBVN007776 Mướp hương 31 B13 GBVN005347 Mướp hương
8 A10 GBVN008861 Mướp hương 32 B14 GBVN005348 Mướp hương
9 A11 GBVN008864 Mướp hương 33 B15 GBVN06568 Mướp Thơm
10 A12 GBVN008866 Mướp hương 34 B16 GBVN006574 Mướp Thơm
11 A13 GBVN009754 Mướp hương 35 B17 GBVN006576 Mướp hương
12 A15 GBVN012229 Mướp hương dạng 2 36 B18 GBVN006578 Mướp hương
13 A16 GBVN012230 Mướp hương dạng 2 37 B19 GBVN006721 Mướp hương
14 A17 GBVN012233 Mướp hương dạng 2 38 B21 GBVN006735 Mướp hương
15 A18 GBVN012235 Mướp hương dạng 2 39 B22 GBVN006737 Mướp hương
16 A19 GBVN012242 Mướp nếp 40 B23 GBVN006778 Mướp hương
17 A20 GBVN005324 Mướp vàng 41 B24 GBVN006779 Mướp Nho Quan
18 A29 GBVN005351 Mướp Trâu 42 B25 GBVN006900 Mướp Hương
19 A30 GBVN 006567 Mướp Dài 43 B26 GBVN006901 Mướp Hương
20 B1 GBVN003694 Mướp hương 44 B27 GBVN006902 Mướp Hương
21 B2 GBVN003695 Mướp hương 45 B28 GBVN006903 Mướp hương
22 B3 GBVN003696 Mướp hương 46 B29 GBVN006904 Mướp hương
23 B4 GBVN003717 Mướp hương 47 B30 GBVN006906 Mướp hương
* Primer: 100 mồi UBC (University of British Columbia) RAPD được tổng hợp bởi công ty Bioneer (Hàn Quốc) được sử dụng trong thí nghiệm để khảo sát tính đa hình của một số giống mướp hương đại diện từ tập đoàn giống mướp hương (dựa vào kết quả thí nghiệm đánh giá đặc điểm hình thái). Các mồi RAPD biểu hiện đa hình giữa một số giống mướp đại diện từ tập đoàn sẽ được chọn để đánh giá kiểu gen của tập đoàn mướp.
Bảng 2.2 Bộ mồi RAPD biểu hiện đa hình
STT Tên mồi Trình tự mồi STT Tên mồi Trình tự mồi
1 UBC#301 CGGTGGCGAA 51 UBC#351 CTCCCGGTGG 2 UBC#302 CGGCCCACGT 52 UBC#352 CACAACGGGT 3 UBC#303 GCGGGAGACC 53 UBC#353 TGGGCTCGCT 4 UBC#304 AGTCCTCGCC 54 UBC#354 CTAGAGGCCG 5 UBC#305 GCTGGTACCC 55 UBC#355 GTATGGGGCT 6 UBC#306 GTCCTCGTAG 56 UBC#356 GCGGCCCTCT 7 UBC#307 CGCATTTGCA 57 UBC#357 AGGCCAAATG 8 UBC#308 AGCGGCTAGG 58 UBC#358 GGTCAGGCCC 9 UBC#309 ACATCCTGCG 59 UBC#359 AGGCAGACCT 10 UBC#310 GAGCCAGAAG 60 UBC#360 CTCTCCAGGC 11 UBC#311 GGTAACCGTA 61 UBC#361 GCGAGGTGCT 12 UBC#312 ACGGCGTCAC 62 UBC#362 CCGCCTTACA 13 UBC#313 ACGGCAGTGG 63 UBC#363 ATGACGTTGA 14 UBC#314 ACTTCCTCCA 64 UBC#364 GGCTCTCGCG 15 UBC#315 GGTCTCCTAG 65 UBC#365 TAGACAGAGG 16 UBC#316 CCTCACCTGT 66 UBC#366 CCTGATTGCC 17 UBC#317 CTAGGGGCTG 67 UBC#367 ACCTTTGGCT 18 UBC#318 CGGAGAGCGA 68 UBC#368 ACTTGTGCGG 19 UBC#319 GTGGCCGCGC 69 UBC#369 GCGCATAGCA 20 UBC#320 CCGGCATAGA 70 UBC#370 TCAGCCAGCG 21 UBC#321 ATCTAGGGAC 71 UBC#371 TCTCGATTGC 22 UBC#322 GCCGCTACTA 72 UBC#372 CCCACTGACG 23 UBC#323 GACATCTCGC 73 UBC#373 CTGAGGAGTG 24 UBC#324 ACAGGGAACG 74 UBC#374 GGTCAACCCT 25 UBC#325 TCTAAGCTCG 75 UBC#375 CCGGACACGA 26 UBC#326 CGGATCTCTA 76 UBC#376 CAGGACATCG
STT Tên mồi Trình tự mồi STT Tên mồi Trình tự mồi
27 UBC#327 ATACGGCGTC 77 UBC#377 GACGGAAGAG 28 UBC#328 ATGGCCTTAC 78 UBC#378 GACAACAGGA 29 UBC#329 GCGAACCTCC 79 UBC#379 GGGCTAGGGT 30 UBC#330 GGTGGTTTCC 80 UBC#380 AGGAGTGAGA 31 UBC#331 GCCTAGTCAC 81 UBC#381 ATGAGTCCTG 32 UBC#332 AACGCGTAGA 82 UBC#382 ATACACCAGC 33 UBC#333 GAATGCGACG 83 UBC#383 GAGGCGCTGC 34 UBC#334 ATGGCAAAGC 84 UBC#384 TGCGCCGCTA 35 UBC#335 TGGACCACCC 85 UBC#385 ACCGGGAACG 36 UBC#336 GCCACGGAGA 86 UBC#386 TGTAAGCTCG 37 UBC#337 TCCCGAACCG 87 UBC#387 CGCTGTCGCC 38 UBC#338 CTGTGGCGGT 88 UBC#388 CGGTCGCGTC 39 UBC#339 CTCACTTGGG 89 UBC#389 CGCCCGCAGT 40 UBC#340 GAGAGGCACC 90 UBC#390 TCACTCAGAG 41 UBC#341 CTGGGGCCGT 91 UBC#391 GCGAACCTCG 42 UBC#342 GAGATCCCTC 92 UBC#392 CCTGGTGGTT 43 UBC#343 TGTTAGGCTC 93 UBC#393 TTCCATGCCT 44 UBC#344 TGTTAGGCAC 94 UBC#394 TCACGCAGTT 45 UBC#345 GCGTGACCCG 95 UBC#395 TCACTTGAGG 46 UBC#346 TAGGCGAACG 96 UBC#396 GAATGCGAGG 47 UBC#347 TTGCTTGGCG 97 UBC#397 GGGCTGTGCC 48 UBC#348 CACGGCTGCG 98 UBC#398 CAGTGCTCTT 49 UBC#349 GGAGCCCCCT 99 UBC#399 TTGCTGGGCG 50 UBC#350 TGACGCGCTC 100 UBC#400 GCCCTGATAT
2.3.2. Hóa chất và thiết bị
2.3.2.1. Hóa chất
Hoá chất: Taq - polymerase (Bioscience, Anh), buffer PCR, MgCl2, dNTP, Agarose, TBE buffer, TE buffer.
2.3.2.2. Thiết bị
Máy PCR
Bộ điện di
Bể ổn nhiệt
Máy lắc (Hàn Quốc)
Hộp UV light
Tủ lạnh sâu -20oC
Tủ ấm Memmert (Đức)
Và một số các thiết bị cần thiết khác như pipette, ..
2.3.3. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được tiến hành tại Viện nghiên cứu Rau quả Gia Lâm Hà Nội - Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học - Nhà lưới của khoa Nông Học, trường Đại Học Nông Lâm.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 2/2014 đến 6/2015.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của tập đoàn giống mướp hương
2.4.1.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp tuần tự không nhắc lại. - Mỗi giống trồng 6 cây
- Có 48 ô trồng tương đương với 48 giống nghiên cứu. - Diện tích ô thí nghiệm: 8.6 m2
- Diện tích toàn thí nghiệm: 413 m2
2.4.1.2. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
* Thời gian sinh trưởng của tập đoàn giống mướp
Thời gian sinh trưởng, phát triển qua các giai đoạn được tính bằng ngày. Thời điểm xác định giai đoạn này khi 50% số cây trên ô thí nghiệm đạt được yêu cầu của mỗi giai đoạn. Bao gồm 7 chỉ tiêu :
Thời gian từ khi gieo đến khi mọc Thời gian từ khi mọc có một lá thật. Thời gian từ khi trồng đến khi phân cành.
Thời gian từ khi trồng đến khi ra hoa đực đầu tiên. Thời gian từ khi trồng đến khi ra hoa cái đầu tiên.
Thời gian từ khi trồng đến khi thu hoạch: Quả thu hoạch phải phát triển tối đa