4. Những điểm mới của đề tài
1.2.3. Những nghiên cứu về Chitosan oligosaccharide
Chitosan là một dạng chitin đã bị khử axetyl, nhưng không giống chitin nó lại tan được trong dung dịch axit. Chitin là polyme sinh học có nhiều trong thiên nhiên chỉ đứng sau xenluloza. Cấu trúc hóa học của chitin gần giống với xenluloza. Chitin có nhiều trong các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ…Đặc tính
của chitosan: là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn, là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH=6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C.
a. Vai trò của chitosan trong nông nghiệp
COS được biết là có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính kháng nấm (Luan et al., 2006), hoạt tính kháng khuẩn (Jeon và Kim, 2001; Jeon và cs, 2001), hiệu ứng tăng cường miễn dịch (Sudharsshan và cs, 1992) và các hiệu ứng bảo vệ chống lại nhiễm trùng (Gerasimenko và cs, 2004). Các tính chất của COS, như độ đề acetyl (DD), sự phân bố điện tích và bản chất hoá học phân tử chi phối mạnh mẽ các hoạt động sinh học của nó (Mujeebur và Tanveer, 2014). Không giống như chitosan trọng lượng phân tử cao, COS dễ dàng hấp thu qua ruột, nhanh chóng đi vào máu và gây các hiệu ứng sinh học có hệ thống. Trong công nghiệp thực phẩm, COS thu hút sự quan tâm lớn hơn như là tác nhân kháng khuẩn, chống oxi hoá và nâng cao chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm (Shahidi, và cs, 1999). Vì vậy, khối lượng phân tử được coi là một đặc tính chủ yếu của COS liên quan nhiều đến hoạt tính sinh học của nó.
- Ức chế vi sinh vật gây bệnh
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đối với một số loài vi khuẩn đã được công nhận và được xem là một trong những tính chất quan trọng nhất liên quan trực tiếp đến các ứng dụng sinh học có thể của nó. Các hoạt tính kháng vi khuẩn của các hợp chất này chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như khối lượng mol trung bình (MW) (Yun và cs, 1999; Park và cs, 2002; Park và cs,
2004), độ deacetyl (Chung và cs, 2004), loại vi sinh vật (Garasimenko và cs, 2004; Park và cs, 2004) và một số tính chất hoá lý khác (Bảng 1).
Bảng 1.5. Nồng độ tối thiểu của COS đểức chế các loài vi khuẩn khác nhau Bacterial strain DD (%) W M (kDa) MIC (%)a Ref.
Vi khuẩn Gram âm
Escherichia coli 85 12 0.1 Gerasimenko et al. (2004)
Escherichia coli 85 6 0.06 Gerasimenko et al. (2004)
Escherichia coli O-157 90 5–10 0.12 Jeon et al. (2001) V brio
parahaemolyticus
75 1–10 0.4 Park et al. (2004b)
Salmonella typhimurium
75–90 1–10 0.125 Park et al. (2004a)
Pseudomonas aeruginosa
50–90 5–10 0.25 Park et al. (2004a)
Vi khuẩn Gram dương
Micrococcus luteus 90 5–10 0.031 Je n t al. (2001)
Streptococcus mutans 90 5–10 0.008 Jeon et al. (2001) Streptococcus faecalis 90 5–10 0.03 Jeon et al. (2001) Staphylococcus
epidermis
75–90 5–10 0.063 Park et al. (2004a)
Staphylococcus aureus 50–90 1–10 0.125 Park et al. (2004a) Bacillus subtilis 75–90 5–10 0.125 Park et al. (2004a)
Bacillius cereus 75–90 1–10 0.125 Park et al. (2004a)
Lactobacillus plantarum 85 12 0.06 Gerasimenko et al. (2004) Bifidobacterium
bifidum
85 12 0.0005 Gerasimenko et al. (2004)
a
Chitosan và COS đã được báo cáo ngăn chăn được sự lây nhiễm virus trong các hệ thống sinh học khác nhau. Trong hầu hết, các cơ chế kháng virus
chưa được hiểu rõ. Tuy nhiên, một trong những giải thích có thể là, điện tích
cation của các nhóm amin của chitosan và COS có thể có các chức năng thêm
vào để hoạt hoá hệ thống miễn dịch và phòng thủ ở thực vật và động vật
(Sekiguchi và cs, 1994). Một số nghiên cứu cho thấy, chitosan có thể ức chế được nhiều loài nấm gây hại trên cây trồng. Đặc biệt như chitosan có thể ức chế sự phát sinh phát triển của nấm Fusarium solani gây bệnh héo vàng trên nhiều loại cây trồng rất hiệu quả (Shimosaka và cs, 1993, Ashley và cs, 1998). Sử dụng chitosan phun lên cây lạc cũng có thể hạn chế được bệnh gỉ sắt lạc (Sathiyabama và Balasubramanian, 1998). Một nghiên cứu khác cho thấy chitosan có thể ức chế được nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên cây đu đủ (Bautista và cs, 2003). Ben-Shaloma và cs, 2003 đã nghiên cứu khả năng kháng bệnh đốm xám trên cây dưa chuột do nấm Botrytis cinerea của chitosan, kết quả cho thấy sử dụng chitosan có khả năng hạn chế được bệnh này. Sử dụng chitosan có thể hạn chế được một số bệnh khác trên cây trồng nông nghiệp như: bệnh chết cây con do nấm Rhizoctonia solani, bệnh héo rũ gốc mốc đen trên cây lạc do nấm Aspegillus
niger gây ra rất hiệu quả (Liu và cs, 2012; Li và cs, 2008)
- Kích thích sinh trưởng cây trồng
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy COS có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng và giảm các tác động xấu của các điều kiện bất lợi đến cây trồng (Kim và Rajapakse, 2005; Phạm Anh Tuấn và Phạm Văn Cường, 2008). Chitosan ảnh hưởng đến phản ứng sinh lý khác nhau như khả năng miễn dịch thực vật, cơ chế phòng vệ liên quan đến nhiều enzyme như, phenylalanine amoni lyase, polyphenol oxidase, tyrosine ammonia lyase và enzym chống oxy hóa viz., Hoạt động superoxide dismutase, catalase và peroxide chống lại các điều kiện bất lợi. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chitosan gây ra cơ chế trong thực vật chống lại nhiều sinh vật (nấm, vi khuẩn và côn trùng) và các yếu tố vô sinh (độ mặn, hạn hán, kim loại nặng và lạnh từ đó nâng cao năng suất cây trồng (Nguyễn Anh Dũng, 2009; Nontalee và cs, 2015).
Một nghiên cứu ở mức độ protein cho thấy 105 protein trong lá lúa biểu hiện khác ở các mức độ khác nhau khi sử dụng chitosan, trong đó sự biểu hiện của 3 protein (sinh hóa của quang hợp, chuyển hóa carbohydrate và tế bào oxi
hóa khử homeostasis) có sự khác biệt lớn. Hơn 90% các gen tích cực trong lục lạp biểu hiện rất tốt, điều này cho thấy COS kích thích sự tăng trưởng của cây lúa qua nhiều cơ chế và rất phức tạp trong nhân và lục lạp (Abdel-Mawgoud và cs, 2010). Một nghiên cứu đã chứng minh rằng xử lý hạt giống lúa bằng COS có thể duy trì tăng trưởng và năng suất tiềm năng của cây lúa trong điều kiện gặp hạn hán (Kutita, 1998; Okamoto và cs, 2003)
b. Cơ chế hoạt động của chitosan
- Hoạt tính trực tiếp chống lại mầm bệnh:
Hoạt tính trực tiếp của chitosan trong việc kháng virut và viroid chủ yếu ở khả năng chitosan bất hoạt quá trình sinh sản của virut hoặc viroid. Nó thâm nhập vào mô tế bào cây, liên kết chặt chẽ với các acid nucleic và gây ra một loạt các thương tổn và gây ức chế lựa chọn. Ngay lập tức, ức chế có chọn lọc này có thể bất hoạt các mRNA mã hõa các gen cần cho quá trình điều trị thương tổn của vi khuẩn. Ngược lại, các nấm, vi khuẩn, oomycete và các côn trùng khác, chitosan tác động thông qua cơ chế gia tăng khả năng đề kháng của cây, giúp cây tiết ra các kháng thể chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn, oomycete (Domard và cs, 2002).
- Hàng rào vật lý quanh vị trí xâm nhập mầm bệnh
Khi chitosan xâm nhập vào mô cây, thường kết dính quanh các vị trí xâm nhập và có 3 tác động chính: Thứ nhất là lập hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan và bảo vệ các tế bào khỏe mạnh khác. Tại vị trí cách ly, cây sẽ nhận biết để kích thích sự phản ứng nhạy cảm giúp tiết ra H2O2 để giúp tăng cường thành tế bào và báo động cho các tế bào bên cạnh. Thứ hai chitosan liên kết các kim loại khác nhau và giúp kích hoạt nhanh chóng quá trình làm lành vết thương. Thứ ba chitosan có điện tích dương, vi khuẩn có điện tích âm do đó chitosan kết dính với vi khuẩn gây ra quá trình rò rỉ protein và các cơ quan nội bào của vi khuẩn, khiến vi khuẩn bị tổn thương nghiêm trọng và chết (Chung và cs, 2004).
- Khả năng tạo liên kết với dinh dưỡng và khoáng chất
Chitosan có khả năng liên kết các kim loại và khoáng (như Fe, Cu) giúp tránh mầm bệnh xâm nhập, gây ức chế quá trình sinh sản và tạo ra độc tố.
Chitosan còn tạo phức với mycotoxin (độc tố do nấm tiết ra), giúp giảm tổn hại ở tế bào chủ do độc tố nấm (Choi và cs, 2001).
- Chất tăng cường làm lành vết thương
Vì khả năng bám chặt vào màng sinh học và các phân tử sinh học cùng với điện tích dương, chitosan cung cấp khả năng làm lành vết thương nhanh chóng khi có tổn hại cơ học hay mầm bệnh tấn công. Vì là chất kích hoạt, chitosan hoạt hóa quá trình tổng hợp và hình thành một loạt các protein PR và các protein bảo vệ trong đó có phenylalanine ammonia-lyase và peroxidase. Hai emzyme này giúp tổng hợp và xây dựng lên ma trận lignin và hình thành tyllose, những chất đóng vai trò quan trọng trong làm lành vết thương (Feng và cs, 2004).
- Kích thích cơ chế phòng thủ của cây trồng
Chất kích hoạt là các chất có khả năng kích thích các phản ứng bảo vệ khi được đưa vào các mô tế bào cây (như oligosaccharit, glycoprotein, peptit và lipit). Các chất kích thích oligosaccharit bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan và oligogalacturonic. Khi cây trồng được tăng cường cơ chế bảo vệ sẽ chịu được sự tấn công mầm bệnh, nhanh chóng khoanh vùng tế bào bị chết và tạo ra các chất sinh hóa xung quanh tế bào bị chết. Các cơ chế này bao gồm tạo ra các oxygen hoạt tính, thay đổi cấu trúc tế bào, tổng hợp các protein kháng thể và tổng hợp sinh học phytoalexin. Chitosan là chất có khả năng kích hoạt các cơ chế phòng thủ của cây. Khi sử dụng chitosan, cây trồng sẽ có một loạt biến đổi về vật lý và sinh lý học. Thay đổi vật lí là sẽ giảm khe hở khí không, giảm khả năng tiếp cận của nấm vào mô tế bào lá. Các tế bào bảo vệ của lá sẽ tạo ra H2O2, để phản ứng lại với sự giảm khe hở khí khổng. Nồng độ acid phenolic trong lá, đặc biệt ferulic acid sẽ gia tăng đáng kể khi gia tăng nồng độ chitosan. Nồng độ lignin trong lá cũng sẽ tăng cao. Các tiền chất của lignin như p-courmaric, ferulic acid, sinapoc acid và phenolic acid có khả năng kháng khuẩn đều bị kích hoạt bởi chitosan. Bản thân các oligogalacturonic là sản phẩm của quá trình phân giải thành tế bào cây do enzyme pectic của vi khuẩn tiết ra do đó khiến cây tạo ra cơ chế bảo vệ Ngoài ra, chitosan là thành phần tìm thấy của nhiều loại nấm. Nên khi các olgigosaccharit giải phóng khỏi chitosan sẽ giúp kích thích cơ chế bảo vệ của cây (Li và cs, 2008, Liu và cs, 2012).
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU