- Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu.
Nguyên liệu lá, thân, rễ cây thuốc sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước sau đó đem sấy khô ở 900C đến khối lượng không đổi.
- Nguyên liệu sau khi sấy khô được nghiền trong máy xay đa năng loại nhỏ thành bột dạng mịn, bảo quản nơi khô ráo để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
24
Nguyên liệu được tách chiết theo phương pháp ngâm nóng. Nguyên liệu dạng bột khô được đem đi chiết với tỷ lệ 20g/100ml bằng dung môi methanol, sau đó cho vào máy lắc với tần số 200 vòng/phút (để các chất có hoạt tính sinh học tan đều trong dung môi) ở các điều kiện thời gian khác nhau (24h, 48h, 72h), sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc, 80ml dịch lọc được đem đi cô đặc bằng máy cô quay (hoặc sấy khô) đến khi có khối lượng khô không đổi và được bảo quản ở 40C để sử dụng trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
- Bước 3: Chuẩn bị giống vi khuẩn
Sử dụng 4 chủng vi khuẩn gồm 2 chủng gram dương là S.a
(Staphylococcus aureus), B.s (Bacillus subtilis); và 2 chủng gram âm làP.a
(Pseudomonas aeruginosa), E.coli (Escherichia coli), lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên. Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường LB, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 370C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
- Bước 4: Thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, thí nhiệm được bố trí 3 lần nhắc lại trên một chủng vi khuẩn 3 đĩa petri trên 1 lần nhắc lại.
Pha các cao chiết của toàn thân cây thuốc với metanol nồng độ 10g/100ml và 5g/100ml sau đó dùng cao đã pha để thử hoạt tính kháng khuẩn.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật độ vi khuẩn đạt đến nồng độ 106 tế bào/ml, lắc đều ống nghiệm chứa vi khuẩn. Môi trường LB đã được hóa lỏng trong lò vi sóng, khi còn lỏng đổ đều môi trường vào các đĩa Petri, sau đó để nguội để môi trường đông đặc lại tạo thành mặt phẳng. Dùng micropipet hút 100μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa
25
thạch chứa môi trường LB (Thành phần của môi trường LB là như sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0), dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục giếng trên môi trường thạch với đường kính 6 mm, đục 2 giếng, mỗi giếng cách nhau 2 – 3 cm. Mỗi giếng thạch nhỏ 100μl dịch cao chiết cần nghiên cứu bằng micropipet, sử dụng đối chứng dương là kháng sinh Kanamycin và Akamicin với nồng độ 5mg/ml để so sánh, để các đĩa thạch trong tủ lạnh 30 phút để dịch cao chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm 370C, sau 24h mang ra đo kích thước vòng kháng khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng khuẩn (BK) bằng công thức: BK = D - d, trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính giếng thạch.
26
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN