Thí nghiệm 1: Sản xuất thể quả nấm Linh chi sử dụng lớp đất che phủ
Nguyên liệu sản xuất thể quả trong nghiên cứu này là mùn cưa và các thân gỗ keo. Các đoạn gỗ keo đường kính khoảng 10 cm trở lên được cắt thành các đoạn ngắn khoảng 20-30 cm, ngâm trong nước 12 giờ, để ráo nước, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Cấy giống cấp 2 với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa giống/1 bịch nấm. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, ít hoặc không có ánh sáng. Khi sợi nấm lan phủ kín cơ chất, loại bỏ túi bóng, chuyển vào các khay đất ẩm, có lỗ thoát nước. Phần đầu khối gỗ keo để hở lên mặt đất. Nuôi cấy dưới các bóng cây, tưới nước đẫm không để bề mặt đất bị khô.
Với cơ chất mùn cưa, phối trộn cám tỉ lệ 5%, hấp khử trùng 1210C trong 3 giờ ở áp suất 1atm. Cấy giống cấp 2 với số lượng xấp xỉ 2-3 thìa
giống/1 bịch nấm. Những bịch mùn cưa có sợi nấm đã bao phủ toàn bộ bề mặt cơ chất, dùng dao rạch các đường dài trên thân bịch. Vùi xuống đất và tưới đẫm nước thường xuyên cho đến khi hình thành thể quả nấm.
Thí nghiệm 2: Sản xuất thể quả nấm Linh chi sử dụng lớp đất được trộn với mùn cưa che phủ
Sử dụng những bịch mùn cưa mà sợi nấm đã bao phủ toàn bộ bề mặt, dùng dao rạch các đường dài trên thân bịch. Phối trộn đất với 10% mùn cưa, bịch nấm được vùi xuống hỗn hợp này và tươi đẫm nước thường xuyên cho đến khi hình thành thể quả nấm.
Thí nghiệm 3: Thử nghiệm phương pháp khử trùng Tyndall
Để tìm kiếm hình thức khử trùng bịch nấm thích hợp các khối gỗ keo được hấp khử trùng theo phương pháp Tyndall, cụ thể: Các khối gỗ keo có khích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, được ngâm nước qua đêm và khử trùng 2-3 lần ở nhiệt độ 1000C. Mỗi lần cách nhau 24 giờ. Cấy bằng giống nấm Linh chi trên cơ chất thóc. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của sợi nấm.
Thí nghiệm 4: Thử nghiệm phương pháp cấy giống
Các khối gỗ keo có kích thước khoảng 20-30cm chiều dài, 15-30mm chiều rộng, được ngâm nước qua đêm và khử trùng 2-3 lần ở nhiệt độ 1000C. Mỗi lần cách nhau 24 giờ. Cấy bằng giống nấm trên cơ chất thóc theo hai hình thức:
Hình thức thứ nhất: Cấy sao cho giông nấm phân bố đều ở 2 đầu bịch nấm. Hình thức thứ hai: Cấy giống ở phần miệng túi.
Điều kiện nuôi cấy ít ánh sáng, nhiệt độ phòng. Theo dõi thời gian sợi nấm lan phủ toàn bộ cơ chất.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập giống nấm Linh chi
4.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau tới khả năng phát triển của mảnh mô thể quả nấm Linh chi
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại môi trường khác nhau gồm môi trường PDA (Potato dextrose agar), môi trường YEPD (Yeast extract peptone dextrose) và môi trường PDA trên tăm bông, kết quả như sau:
Trên môi trường PDA, sau 2 ngày nuôi cấy có thể quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô (Hình 2). Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm đã phủ kín bề mặt đĩa petri. Sợi nấm có màu trắng đồng nhất không lẫn mốc xanh, vàng,...
Hình 2. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi trên môi trường PDA
Trên cơ chất tăm bông, mảnh mô thể quả nấm phát triển tốt, sau 2 ngày nuôi cấy quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô (hình 3A). Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm bao phủ toàn bộ khối tăm bông (hình 3B).
A. Sau 2 ngày nuôi cấy B. Sau 10 ngày nuôi cấy
Hình 3. Nuôi cấy hệ sợi trên tăm bông
Trên môi trường YEPD, sau 2 ngày nuôi cấy có thể quan sát thấy sợi nấm mọc ra từ mảnh mô. Sau 10 ngày nuôi cấy sợi nấm đã phủ kín bề mặt đĩa petri (Hình 4A và 4B). Sợi nấm có màu trắng đồng nhất không lẫn mốc xanh, vàng,...
A. Sau 4 ngày nuôi cấy B. Sau 10 ngày nuôi cấy
Hình 4. Nuôi cấy mô thể quả nấm Linh chi
4.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của mốc xanh trên môi trường phân lập nấm Linh chi
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sự sinh trưởng của vi sinh vật lây nhiễm, điển hình và phổ biến nhất là nấm mốc xanh, mẫu nấm mốc xanh được thu nhận từ bịch nấm lây nhiễm được cấy lên môi trường YEPD
bổ sung các nồng độ NaCl lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Kết quả cho thấy tại các nồng độ NaCl 1%, 2%, 3%, 4%, nấm mốc xanh phát triển bình thường, không có dấu hiệu bị ức chế. Trên môi trường YEPD bổ sung nồng độ NaCl 5% nấm mốc xanh có dấu hiệu phát triển chậm.
Điều này cho thấy có thể hạn chế phần nào sự lây nhiễm bằng việc bổ sung những thành phần có khả năng ức chế sự phát triển của nấm hoang dại. Tuy nhiên những thành phần bổ sung này cần đảm bảo không ức chế sự phát triển của nấm Linh chi. Các nồng độ NaCl cao hơn sẽ tiếp tục được thử nghiệm trong tương lai.
4.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối ăn (NaCl) tới khả năng phát triển của sợi nấm Linh chi, giống nấm Linh chi được nuôi cấy trên môi trường YEPD được bổ sung các nồng độ NaCl lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Kết quả như sau: Ở nồng độ NaCl 1% và 2% sợi nấm phát triển tốt, sợi nấm mọc trắng đều. Ở nồng độ NaCl 3%, 4% sợi nấm phát triển kém dần và không phát triển ở nồng độ NaCl 5% (Hình 5).
Hình 5. Sự phát triển của sợi nấm Linh chi trên môi trường YEPD bổ sung NaCl
Từ kết quả trên cho thấy, nồng độ NaCl có ảnh hưởng tới sợi nấm Linh chi theo những tỉ lệ nhất định. Trong những môi trường nuôi cấy hoặc những điều kiện thí nghiệm nồng độ NaCl không nên vượt quá 3%. Khi sử dụng NaCl như một yếu tố nhằm hạn chế sự lây nhiễm bịch nấm. Vị trí phun dung dịch NaCl nên tránh vị trí cấy giống để tránh những ảnh hưởng tiêu cực tới sự phát triển của meo nấm.
4.2. Sản xuất meo nấm
4.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của loại cơ chất tới khả năng sinh trưởng của nấm Linh chi
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại cơ chất khác nhau gồm hỗn hợp thóc và CaCO3, hỗn hợp mùn cưa và cám, hỗn hợp thóc và mùn cưa, kết quả như sau:
Trên cơ chất thóc, được phối trộn 1% CaCO3 theo công thức của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự [2]. Sau 3-4 ngày, sợi nấm phát triển từ mảnh mô với màu sắc và hình thái đặc trưng. Tuy nhiên khi tới phần giữa túi cơ chất, tốc độ nấm phát triển chậm, xuất hiện mùi chua do thóc ở phần đáy túi có độ ẩm cao. Các giọt nước đọng trên thành túi làm thóc bị nát, gây dính sợi nấm. Tỉ lệ giống bị hỏng cao, lên tới 100%. Điều này có thể do quá trình chuẩn bị nguyên liệu, thóc bị luộc quá nát hoặc quá trình phơi thóc chưa đạt độ ẩm thích hợp. Việc này yêu cầu kinh nghiệm tích lũy trong thời gian lâu dài.
Trên cơ chất mùn cưa bổ sung 5% cám và cơ chất hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa sau khoảng 3 ngày nuôi cấy, sợi nấm phát triển mạnh từ mảnh mô. Sợi nấm có màu trắng, mùi thơm nhẹ. Sợi nấm mọc dày. Không xuất hiện các màu bất thường như màu mốc xanh, mốc vàng, mốc đen. Trên cơ chất mùn cưa bổ sung 5% cám, sợi nấm bao phủ khoảng hơn 80% túi cơ chất sau 40 ngày nuôi cấy (Hình 6A), tỉ lệ bịch thành công 100%. Như vậy thời gian sản xuất meo nấm theo phương pháp này có tỉ lệ thành công cao, tuy
nhiên thời gian sản xuất lâu dài. Vì vậy cần có những phương pháp cải tiến thích hợp hơn. Với cơ chất là hỗn hợp thóc bổ sung 10% mùn cưa, sợi nấm mọc kín sau khoảng 25-30 ngày nuôi (Hình 6B). Kết quả này phù hợp với phương pháp sản xuất meo giống của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự. Mùn cưa có khả năng hút ẩm, nhờ vậy có thể giảm thiểu nguy cơ chua hỏng thóc nguyên liệu. Phương pháp này có thể áp dụng cho những người chưa có nhiều kinh nghiệm trong quá trình sản xuất meo giống. Dù vậy, do mùn cưa chứa ít chất dinh dưỡng, tỉ lệ mùn cưa cần được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng giống nấm trong sản xuất trong tương lai.
A. Sợi nấm phát triển trên hỗn hợp mùn cưa, cám sau 40 ngày nuôi cấy
B. Sợi nấm phát triển trên hỗn hợp thóc, mùn cưa sau 30 ngày nuôi cấy
Hình 6. Sản xuất meo nấm trên cơ chất 4.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của loại giống cấy. Hai loại giống gồm giống nấm trên môi trường agar và giống nấm mọc trên tăm bông được thử nghiệm. Với giống cấy từ môi trường agar, sợi nấm lan phủ kín túi cơ chất trong khoảng thời gian 25-30 ngày. Trên túi cơ chất cấy bằng tăm bông, thời gian lan phủ kín sợi nấm khoảng 15 ngày. Với giống bằng tăm bông sợi nấm được cấy dọc theo bịch nấm nhờ vậy sẽ lan phủ bịch cơ chất ở cả vị trí đáy túi và
miệng túi. Nhờ vậy rút ngắn được thời gian lan phủ cơ chất. Từ kết quả trên giống nấm cấy trên tăm bông sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm
Để đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm. Phối trộn thóc và mùn cưa với tỉ lệ lần lượt là 0% 5%, 10%, 15% và 20%. Kết quả như sau:
Sau 2-4 ngày nuôi cấy, quan sát thấy sợi nấm bắt đầu mọc ra từ que tăm bông (Hình 7A). Sợi nấm mọc lan kín bịch thóc trong 15 ngày nuôi cấy (Hình 7B). Sự phát triển sợi nấm Linh chi ở 4 tỷ lệ cho kết quả không khác biệt về thời gian lan phủ cơ chất. Vì vậy, để khai thác tốt nguồn dinh dưỡng của thóc cho giống nấm đồng thời khai thác tốt vai trò hút ẩm của mùn cưa, tỉ lệ mùn cưa 5% được lựa chọn để sản xuất meo nấm với giống cấy tăm bông, trên có chất chính là thóc.
A. Sau 4 ngày nuôi cấy
A. Sau 15 ngày nuôi cấy
Hình 7. Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ mùn cưa phối trộn với cơ chất thóc trong sản xuất meo nấm
4.3. Sản xuất thể quả nấm Linh chi
Để sản xuất thể quả nấm Linh chi, các bịch mùn cưa và các thân gỗ keo được cấy giống và nuôi cấy trong các khay/túi đất ẩm. Kết quả cho thấy sau khoảng 15 ngày, thể quả trên các bịch mùn cưa nhú qua lớp đất mỏng (Hình 8A). Thể quả có hình dạng và màu sắc đặc trưng của nấm Linh chi, thể quả trên các bịch mùn có kích thước nhỏ do khối lượng cơ chất thử nghiệm hạn chế (nhỏ hơn 1kg). So sánh bịch nấm được phủ đất với bịch nấm không phủ đất, thể quả của bịch nấm có lớp đất phủ có thời gian tăng trưởng dài hơn, thể quả có kích thước lớn hơn (Hình 8B). Với các bịch nấm phủ hỗn hợp đất và mùn cưa (Thí nghiệm 2), sau 3-4 tuần quan sát thấy mầm thể quả nhú lên trên lớp đất bao phủ. Tuy nhiên do thời gian có giới hạn nên chưa tạo thành thể quả hoàn chỉnh. Vì vậy cần tiếp tục theo dõi và đánh giá.
A. Sản xuất thể quả khi vùi xuống đất
B.Sản xuất thể quả trên bịch nấm phủ đất và không phủ đất
Hình 8. Sản xuất thể quả
Để tìm kiếm phương án khử trùng thích hợp và đơn giản, phương pháp Tyndall được thử nghiệm trên các bịch mùn cưa gỗ keo. Kết quả, sau 1 tuần nuôi cấy không xuất hiện các giống nấm mốc xanh, mốc đen. Sợi nấm phát triển tốt, che phủ hơn 50% diện tích cơ chất (Hình 9).
Hình 9. Bịch nấm khử trùng theo phương pháp Tyndall
Để thử nghiệm hình thức cấy thích hợp các bịch nấm được cấy theo hai hình thức: Cấy ở cả 2 phía và cấy ở 1 phía của khối cơ chất. Kết quả cho thấy bịch nấm được cấy từ 2 phía có thời gian lan phủ nhanh. sau 1 tuần nuôi cấy đã lan phủ phần lớp diện tích bề mặt cơ chất (Hình 9). Trong khi đó bịch nấm cấy ở diện tích trên miệng túi có tốc độ lan phủ cơ chất chậm. Ở các vị trí không có sợi nấm bao phủ, các loại nấm mốc nhiễm xuất hiện làm giảm chất lượng của bịch nấm(Hình 10).
Những kết quả thử nghiệm trên cho thấy quá trình nuôi trồng nấm có thể nuôi trồng trong những điều kiện thiết bị đơn giản với nhiệt độ khoảng 1000C. Tuy nhiên cần kết hợp nhiêu kỹ thuật, phương pháp nuôi trồng phù hợp để có kết quả tốt nhất.
Phần 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Đã phân lập được giống nấm Linh chi từ thể quả bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô.
Đã nuôi cấy thành công giống nấm sau phân lập trên tăm bông, giúp giảm thời gian sản xuất meo nấm từ khoảng 25-30 ngày xuống khoảng 14- 15 ngày.
Đã sản xuất thành công meo nấm trên cơ chất thóc phối trộn với mùn cưa và trên cơ chất mùn cưa phối trộn với cám.
Đã sản xuất thành công thể quả nấm Linh chi khi sử dụng lớp đất che phủ.
5.2. Kiến nghị
Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm Linh chi với lớp đất che phủ. Đánh giá ảnh hưởng ức chế của nồng độ muối tới sự phát triển của sợi nấm mốc lây nhiễm trong bịch cơ chất nấm Linh chi.
Tách chiết dược chất trong nấm Linh chi nuôi trồng bán tự nhiên và so sánh với các mẫu nấm thu nhận trong môi trường tự nhiên và môi trường lán trại.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tiếng Việt
1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2. Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ trồng nấm, Tập 1 và 2. Nhà xuất bản
Nông nghiệp Hà Nội.
3. Vi Đại Lâm, Nguyễn Xuân Vũ, Đinh Văn Thiện, Nguyễn Thị Trang, Vũ Đình Hợi, Bùi Thanh Ngọc (2018), Phân lập và sản xuất thử nghiệm giống nấm da báo tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN, 180(04): 117 - 121.
Tiếng Anh
4. Ahmet Unlu, Erdinc Nayir, Onder Kirca, Mustafa Ozdogan (2016)
Ganoderma Lucidum (Reishi Mushroom) and Cancer, J BUON, Jul-Aug,
21(4):792-798.]
5. Chi H.J. Kao, Amalini C. Jesuthasan, Karen S. Bishop, Marcus P. Glucina, Lynnette R. Ferguson (2013), Anticancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients and pathways, Functional Foods in Health and Disease; 3(2):48-65
6. Kent H. McKnight ( 1987) Peterson field guides-Mushroom, Library of Congress cataloging in publication data
XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG ……… ……… ……… ……… ………
Thái Nguyên ngày…. tháng….năm…
Người nhận xét phản biện
(chữ ký và ghi rõ họ tên)
Người hướng dẫn