1. Môi trƣờng nuôi cấy:
1.1. Khái niệm về môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là một hổn hợp nhân tạo có chứa các yếu tố cần thiết cho sự phát ttriển của vi khuẩn một cách thuận lợi.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn rất thay đổi. có loại vi khuẩn mọc ở môi trường tổng hợp chứa muối vô cơ kể cả muối amoni, thêm một hợp chất đơn giản như glucoza hoặc asparagin làm nguồn cácbon và năng lượng, trong khi các loại vi khuẩn khác đòi hỏi những hợp chất đặc biệt chỉ tiìm thấy trong máu hoặc mô động vật.
1.2. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Có nhiều cách phân loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn, có thể dựa vào tính chất vật lý môi trường, đặc điểm dinh dưởng, tính chọn lọc...
1.2.1. Môi trường lỏng và môi trường đặc
- Môi trường lỏng: nước pepton hoặc nước thịt hoặc cao thịt hoà tan trong
nước, trong phòng thí nghiệm hat được gọi là canh thang. môi trường lỏng thường được dùng để tăng sinh vi khuẩn.
- Môi trường đặc: môi trường lỏng thêm1-2% thạch (agar) tuỳ theo yêu cầu
nuôi cấy, mục đích dùng để phân lập vi khuẩn, nếu dùng 0,5% thạch thì tạo ra môi trường thạch mềm, hay dùng để giử chủng vi khuẩn hay thử nghiệm tính di động của vi khuẩn.
1.2.2. Môi trường tối thiểu và môi trường cơ bản
- Môi trường tối thiểu: môi trường tổng hợp chỉ có nước và chứa muối vô cơ
kể cả muối amoni, thêm một hợp chất đơn giản như glucoza hoặc aspagarin làm nguồn cacbon và năng lượng.
- Môi trường cơ bản: môi trường dinh dưỡng cơ bản chứa pepton và nước thịt
hoặc cao thịt. Từ môi trường dinh dưỡng trên có thể biến đổi theo nhiều cách để tạo các loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Để điều chế môi trường đặc chỉ cần thêm thạch, môi trường phong phú thêm huyết thanh, nước báng hoặc máu khử tơ huyết.
1.2.3. Môi trường thường và môi trường phong phú
- Môi trường thường: chỉ chứa thành phần của môi trường cơ bản, đó là chứa
30
- Môi trường phong phú: chứa thành phần của môi trường cơ bản, thêm huyết
thanh, nước báng hoặc máu khử tơ huyết.
1.2.4. Môi trường thông thường và môi trường chọn lọc
- Môi trường thông thường: có thể nuôi cấy các loại vi khuẩn hiếu khí không
có nhu cầu dinh dưỡng cao, các loại vi khuẩn mọc trên môi trường này không tạo khuẩn lạc có những tính chất riêng biệt để có thể giúp chẩn đoán hoặc phân biệt các loại vi khuẩn.
- Môi trường chọn lọc: dùng để phân lập nuôi cấy vi khuẩn, có thể chứa thêm
những tác nhân ức chế cho phép những vi khuẩn cần phân lập phát triển nhưng lại ức chế các vi khuẩn khác., khi mọc trên các môi trường nuôi cấy này chúng tạo ra những hình thái khuẩn lạc, tính chất nuôi cấy tương đối điển hình, có giá trị để phân biệt và giúp chẩn đoán, định danh loài vi khuẩn. Tuỳ theo mức độ chọn lọc mà người ta chia tính chất chọn lọc của các loại môi trường khác nhau:
+ Môi trường có tính chọn lọc thấp: cho phép một vài loại vi khuẩn mọc,
có thể tạo những tính chất riêng. Ví dụ: Thạch lactose đỏ phenol dùng để phân lập E.coli, Salmonella và Shigella ở trong phân, môi trường Mac-Conkey chỉ cho các trực khuẩn Gram âm mọc...
+ Môi trường có tính chọn lọc vừa phải: cho phép một vài loại vi khuẩn
mọc, tạo những tính chất riêng. Rất có giá trị trong xác định và định danh vi khuẩn, ví dụ môi trường SS (Shigella-Salmonella), môi trường DCA (Deoxycholat Citrat Agar)... hay dùng để phân lập vi khuẩn đường ruột; môi trường thạch máu để quan sát liên cầu, phế cầu.
+ Môi trường có tính chọn lọc cao: cho phép một hoặc vài loại vi khuẩn mọc, tạo những tính chất rất riêng biệt, rất có giá trị để xác định vi khuẩn cần phân lập. Ví dụ môi trường pepton kiềm mặn, thạch kiềm mặn để phân lập vi khuẩn tả, môi trường Chapmann để phân lập tụ cầu vàng gây bệnh, môi trường EMB (Eosin Methylen Blue) để xác định E.coli, môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Agar) dùng để phân lập vi khuẩn tả.
Trong phòng thí nghiệm để phân lập một loại vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn người ta sử dụng những quá trình phân lập trong đó cần thiết phải lựa chọn các môi trường nuôi cấy thích hợp cho mỗi loại bệnh phẩm và loại vi khuẩn cần phân lập.
2. Nuôi cấy vi khuẩn
Người ta nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường thích hợp lỏng hoặc đặc. Môi trường lỏng thông dụng nhất là canh thang. Dùng que cấy hoặc pipet Pasteur cho bệnh phẩm vào canh thang. Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp, thông thường 360C trong thời gian 18-24 giờ. Vi khuẩn phát triển làm đục môi trường.
31
Môi trường đặc thông dụng nhất là thạch dinh dưỡng đổ vào ống nghiệm tạo thành mặt phẳng nghiêng gọi là thạch nghiêng hoặc tạo thành một hình trụ gọi là ống thạch, hoặc đổ vào hộp petri gọi là thạch đĩa. Ở mặt thạch dinh dưỡng vi khuẩn phát triển từ một tế bào riêng rẽ dính lại với nhau thành một quần thể trông thấy bằng mắt gọi là khuẩn lạc. Kích thước, màu sắc, hình thái khuẩn lạc khác nhau ở mỗi loại vi khuẩn nên dựa vào khuẩn lạc ở môi trường đặc người ta có thể phân lập được các loại vi khuẩn ròng.
Hình thái khuẩn lạc có thể biến đổi trong quá trình cấy chuyển. Khuẩn lạc của phế cầu lúc mới phân lập thì trong suốt, lồi, bóng gọi là khuẩn lạc S rất độc lực, nhưng cấy chuyển nhiều lần ở phòng thí nghiệm thì vi khuẩn tạo thành những khuẩn lạc nhỏ, khô, xù xì gọi là khuẩn lạc R độc lực kém.
Người ta cấy vi khuẩn với pipet Pasteur hoặc với que cấy: Pipet Pasteur dùng để cấy bệnh phẩm lỏng vào canh thang hoặc ở trên mặt thạch. Ở canh thang, sau khi lấy bệnh phẩm, cho pipet Pasteur vào ống canh thang cho tới khi đầu nhọn pipet chạm vào canh thang.
Que cấy dùng để cấy bệnh phẩm đặc. Que cấy gồm 2 loại: que cấy thẳng và que cấy vòng mang một vòng tròn ở đầu kim. Que cấy vòng dùng để ria cấy ở mặt thạch hoặc cấy vào canh thang. Que cấy thẳng dùng để cấy ở bề sâu của thạch ống.
3. Phân lập bằng ria cấy
Muốn phân lập vi khuẩn ròng thì phải ria cấy ở mặt thạch để thu những tế bào riêng rẻ phát triển thành khuẩn lạc. Có nhiều phương pháp ria cấy ở mặt thạch, thông thường nhất là 2 phương pháp sau:
- Phương pháp Pasteur: Người ta làm thưa dần số lượng vi khuẩn bằng cách
trải đều số lượng vi khuẩn từ ô 1 qua ô 2 qua ô 3 và cuối cùng từ ô 3 qua ô 4 là nơi ta có các tế bào riêng lẻ để phân lập. Chia mặt thạch làm 4 ô dùng vòng cấy lấy bệnh phẩm và trải lên ô 1 dưới hình thức 1 gạch dài và rộng. Đốt vòng cấy, chạm vào thạch nơi đường cấy ở ô 1, trải đều bệnh phẩm từ ô 1 qua ô 2, từ ô 2 qua ô 3 và từ ô 3 qua ô 4 bằng những đường cấy qua lại từ trên xuống dưới. Phương pháp này dùng để cấy các bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn thấp.
- Phương pháp cạn dần: Lấy một quai cấy bệnh phẩm cho vào một ống thạch
nghiêng, nhúng vào bên cạnh nơi có nước đọng ở phía dưới kéo từ từ tới đầu trên của thạch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que cấy qua lại để để vạch trên mặt thạch những vạch chữ chi gần như song song với nhau, rồi dùng que cấy trên cấy lên những ống thạch nghiêng khác. Sau khi ủ ở tủ ấm sẽ xuất hiện trên mặt thạch của ống thứ 2 hoặc thứ 3 những khuẩn lạc riêng rẽ.
Phương pháp cấy cạn dần có thể sử dụng để cấy các bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn thấp cũng như bệnh phẩm có mật độ vi khuẩn cao.
32
Phương pháp ria cấy kiểu Pasteur
Một số cách ria cấy trên thạch đĩa Petri
33