1.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
Để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật có thể tiến hành hai phương pháp là phương pháp đĩa giấy khuếch tán và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.
1.5.2 Xác định giá trị MIC
Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn hoặc lỏng. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường, sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4].
1.5.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học [24]
Kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc: Các bản sắc ký sau khi khai triển bằng hệ dung môi thích hợp được đặt trên bề mặt thạch đã cấy vi sinh vật để chất thử khuếch tán. Các vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật trên bản SKLM sẽ cho vùng ức chế vi sinh vật trên đĩa thạch.
Kỹ thuật hiện hình sinh học ngâm: Bản SKLM sẽ đươc ngâm hoặc che phủ bằng môi trường thạch sau đó vi sinh vật thử nghiệm được cấy lên tấm sắc ký và đem đi ủ. Sau thời gian thích hợp, vi sinh vật sẽ phát triển trên mặt SKLM tại vị trí không có chất ức chế .
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Rễ cốt khí củ được thu mua tại đường Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, Tp. Hồ Chí Minh. Nguyên liệu được định danh dựa vào hình ảnh và tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn. Mẫu nguyên liệu sau khi sơ chế được xay nhỏ đến dạng bột thô, bảo quản trong bao nylon kín.
2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm
Vi sinh vật thử nghiệm do Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh lưu trữ và cung cấp.
Bảng 2.1 Các vi si sinh vật thử nghiệm
Stt Tên vi sinh vật Mã số
1 Escherichia coli ATCC 25922
2 Meticilline - resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300
3 Meticilline - susceptible Staphylococcus aureus ATCC 29213
4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
5 Candida albicans ATCC 10231
2.1.3 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật
Môi trường 1: Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Peptone casein 10 g
Glucose 20 g
Agar 15 g
Môi trường 2: Tryptic Soy Agar (TSA) Pepton 15 g Pepton đậu nành 5 g NaCl 5 g Agar 15 g Nước cất 1 lít
Môi trường 3: Mueller hinton agar (MHA)
Beet extract 2 g
Acid Digest của Casein 17.5 g
Tinh bột 1.5 g
Agar Bios Special 17 g
Nước cất 1 lít
2.1.4 Hóa chất, dung môi
Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi
Stt Hóa chất Xuất xứ
1 Ethanol 50 % Trung Quốc
2 Ethanol 80 % Trung Quốc
3 Ethanol 96 % Trung Quốc
4 n - hexan Trung Quốc
5 Chloroform Trung Quốc
6 Methanol Trung Quốc
7 Ethyl acetat Trung Quốc
8 DMSO
Cách pha dung môi
Pha dung môi ethanol (TT):
Xách định độ cồn cần pha loãng: Cho lượng cồn cần pha loãng vào ống đong 250 ml. Thả nhẹ nhàng cồn kế vào trong ống đong để yên 2 phút. Đọc và ghi các kết quả
nhiệt độ trên nhiệt kế, độ cồn biểu kiến trên cồn kế. Độ cồn biểu kiến ≥ 56 %, tra bảng Gay – Lussac. Tính lượng cồn cao độ cần dùng X = p x b-ca-c x: Thể tích cồn cao độ cần lấy (ml)
p: Thể tích cồn cần pha (ml) a > b > c: Độ cồn thực (%)
Pha dung môi DMSO 10 % (TT):
Dung môi DMSO 10 % (TT) được pha từ dung dịch DMSO 100 % (TT) với dung môi pha loãng là nước cất.
Pha 5 ml DMSO 10 % (TT): Dùng micropipet hút 4,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm có nắp. Tiếp theo hút 0,5 ml DMSO 100 % (TT) cho vào ống nghiệm. Lắc ống nghiệm cho DMSO 100 % (TT) phân bố đều.
2.1.5 Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng
Stt Thiết bị Model Nguồn gốc
1 Bếp cách thủy HH – S6 Trung Quốc
2 Đèn UV254, UV365 CM - 10 Mỹ
3 Cân phân tích Sartorius Đức
4 Tủ hood BS - 122 Việt Nam
5 Lò hấp tiệt trùng Hirayama Nhật
6 Tủ vô trùng Esco AVC – 4A1 Mỹ
7 Tủ ấm RI 28 -2 Mỹ
8 Máy vortex 3412EU Đức
Các dụng cụ sử dụng: Bình lắng gạn, pipet, phễu, bình sắc ký, bản mỏng silicagel 60 F254, erlen, becher, ống nghiệm.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát sơ bộ thực vật học rễ cốt khí củ
2.2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái rễ: Mô tả đặc điểm thực vật học dựa trên quan sát mẫu dược liệu đã chọn.
2.2.1.2 Khảo sát cấu tạo vi học bột dược liệu: Nhận xét cảm quan và quan sát dưới kính hiển vi và so sánh với tài liệu.
Chuẩn bị bột soi:
Dược liệu được cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60 oC, tán nhỏ, dùng máy xay nghiền nát thành bột. Rây qua rây số 32 (rây mịn), phần còn lại trên rây được tán, xay lại và rây tiếp cho đến khi tất cả dược liệu thành bột mịn. Quan sát bột bằng cảm quan (nhận định màu sắc, mùi vị,…..) trước khi soi kính hiển vi.
Lên tiêu bản dược liệu:
Cho một giọt nước vào giữa phiến kính. Dùng que sạch trộn đều bột, lấy một ít bột cho vào giữa giọt nước, dùng 1 góc của lá kính (lamelle) khuấy nhẹ để phân tán bột rồi đật lamelle lại. Dùng ngón tay trỏ di nhẹ trên lamelle để các phân tử của bột tách rời và phân tán đều, đồng thời loại bớt bọt khí. Loại bỏ phần bột và nước thừa phía ngoài lamelle bằng khăn giấy, lau sạch mặt lamelle và phiến kính trước khi soi kính hiển vi.
2.2.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu: Dùng phản ứng hóa học dựa theo phương pháp Ciuleyđể xác định nhóm hợp chất có trong dịch chiết [13].
Alkaloid Coumarin Flavonoid Tanin Saponin Hợp chất khử
Acid hữu cơ Dịch
chiết cồn
Bốc hơi đến cắn, hòa trong nước acid. Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid.
Hiện tượng: Có tủa.
Phản ứng với thuốc thử Fehling. Hiện tượng: Tủa đỏ gạch.
Bốc hơi đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi UV365.
Hiện tượng: Tăng cường độ phát quang.
Làm phản ứng Cyanidin. Hiện tượng: Có màu đỏ.
Phản ứng với dung dịch FeCl3
và dung dịch gelatin muối. Hiện tượng: Xanh rêu/ xanh đen với FeCl3. Tủa bông với gelatin.
Bốc hơi đến cắn. Hòa trong nước, lắc mạnh.
Hiện tượng: Bọt bền trên 15 phút.
Thêm một ít tinh thể Na2CO3.
Hiện tượng: Có bọt khí.
2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết xuất rễ cốt khí củ
Khảo sát với 3 dung môi: Ethanol 50 % (TT), ethanol 80 % (TT) và ethanol 96 %
(TT) và tiến hành chiết xuất theo quy trình sau:
Làm ẩm 5 g bột dược liệu với 20 ml mỗi dung môi trong 30 phút. Bổ sung thêm 30 ml dung môi đã chọn và ngâm lạnh trong 24h. Lọc, dịch chiết được cô trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 80 oC đến khi còn khoảng 20 ml.
Dịch chiết trên được dùng để khảo sát hệ dung môi pha động và chọn độ cồn thích hợp cho chiết xuất.
Mẫu thử: Dùng pipet khắc vạch 10 ml hút 5 ml dịch chiết của từng mẫu, cô cách thủy ở 80 oC tởi cắn bằng chén sứ. Hòa tan cắn với 2 ml CHCl3.
Chấm khoảng 5 μl dịch chiết lên bản mỏng silica gel 60 F254 và triển khai bằng các hệ dung môi với tỉ lệ khác nhau. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí hay sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Sau đó, phát hiện bằng cách soi UVở bước sóng 254 nm và 365 nm. Điều kiện sắc ký lớp mỏng:
Lượng mẫu chấm: 5 μl Bản silica gel 60 F254
Pha động: Toluen – EtOAc (93:7), CHCl3 – EtOAc (11:1) và MeOH – EtOAc – H2O (13,5:100:10).
Khai triển 1 lần
Phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
2.2.3 Khảo sát việc chiết tách cao toàn phần và tách phân đoạn với dung môi có độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ. độ phân cực khác nhau từ rễ cốt khí củ.
2.2.3.1 Chiết xuất cao toàn phần: Phương pháp ngâm lạnh
Làm ẩm 1 kg bột dược liệu với 500 ml ethanol 80 % (TT) trong 30 phút. Thêm 4,5 lít ethanol 80 % (TT), tiếp tục ngâm lạnh trong 72h. Sau đó, lọc và thu dịch chiết, tiếp tục chiết lạnh bã dược liệu còn lại với 5 lít ethanol 80 % (TT) trong 72h. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi, thu được cao toàn phần.
2.2.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
các phân đoạn có độ phân cực khác nhau. Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn.
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn Cao chloroform
Dịch nước
Cao ethyl acetat
Dịch nước Cao nước Cao n – hexan Dịch nước Bột dược liệu Cao toàn phần Ethanol 80 % (TT) x 2 lần Lắc với n – hexan Lắc với chloroform
2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của rễ cốt khí củ
2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Nguyên tắc phương pháp: Bơm dung dịch thử vào các giếng đã được đục lỗ. Nếu chất thử có sự ức chế vi khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh đĩa. Dựa vào đường kính đo vùng ức chế có thể đánh được khả năng kháng khuẩn của mẫu thử.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm: Môi trường sau khi được pha và hấp khử trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm. Thể tích môi trường khoảng 20 – 25 ml/đĩa (đĩa có đường kính 90 mm). Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị vi sinh vật:
- Vi khuẩn: Sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở 37 °C trong 24 giờ, vi khuẩn được pha trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 625 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml.
- Nấm men được hoạt hóa trong môi trường SDA (Candida albicans) trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 37 ℃. Sau đó phân tán trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi nấm được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 530 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 5 x 106
CFU/ml. Vi khuẩn, vi nấm sau khi được pha chế phải được sử dụng trong vòng 30 phút.
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn hòa tan vào trong 1 ml DMSO 10 % (TT).
Tiến hành khảo sát: Huyền dịch vi khuẩn được trải đều trên mặt thạch bằng que bông vô trùng. Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60°. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn được trải đều. Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng ống thép không rỉ. Cho vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn.
Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp môi trường. Ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở 37 °C.
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ đối với vi khuẩn và 20 – 24 giờ đối với vi nấm. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh lỗ. Đo và ghi nhận đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất bằng 0,01 mm. Khả năng kháng mạnh hay yếu được đánh giá sơ bộ bằng giá trị đường kính vòng ức chế theo bảng 2.4.
Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật [29]
Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật ≥ 15 Mạnh 10 - 14 Vừa < 9 Yếu 0 Không kháng
2.2.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MIC
Những mẫu cao có tác động ức chế sẽ được thử nghiệm tìm MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.
Nguyên tắc: Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường thích hợp, sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4].
Phương pháp: Pha loãng trong môi trường rắn.
Chuẩn bị dung dịch: Hòa tan chính xác lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn trong DMSO 10 % (TT) thành dung dịch mẹ. Từ dung dịch mẹ, pha loãng với môi trường MHA thành dãy có 10 nồng độ chất thử giảm dần với độ pha loãng là 2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1. Khi sử dụng pha loãng tiếp với dung môi DMSO 10 % (TT) 10 lần để có mật độ khoảng 107 CFU/ ml.
Tiến hành khảo sát: Chấm 1 µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37 °C.
Đọc kết qua sau 16 – 18 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại.
Đọc kết quả: Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất tại đó ức chế vi sinh vật mọc lên đĩa thạch. Lặp lại 3 lần.
2.2.4.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học
Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Nguyên tắc: Dựa vào phương pháp khuếch tán trên thạch. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1.
Tiến hành SKLM mẫu cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat: Chấm 2 điểm mẫu cao n – hexan, chloroform, ethyl acetat và triển khai song song trên cùng một bản mỏng trong cùng điều kiện. Sau khi triển khai 1 điểm chấm được dùng để phát hiện bằng cách soi UVở bước sóng 254 nm, xác định số vết và giá trị Rf. Điểm chấm còn lại được dùng để phát hiện vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Bản mỏng sau khi triển khai, đuổi hết dung môi để nguyên hoặc cắt ra thành từng mảnh và đặt trên bề mặt thạch đã có trải vi khuẩn thử nghiệm. Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó ủ ở điều kiện thích hợp. Các vết cho hoạt tính sẽ cho vòng ức chế vi khuẩn trên bề mặt.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả
3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ 3.1.1.1 Mô tả hình thái 3.1.1.1 Mô tả hình thái
Rễ cốt khí củ hình trụ cong queo, vỏ sần sùi, nhăn nheo, màu nâu xám, có các đốt lồi lên chia củ thành từng gióng. Những rễ củ to được cắt thành lát mỏng 1 – 2 cm, phơi khô. Mặt cắt ngang thấy phần vỏ mỏng, phần gỗ dày. Thể chất rắn, có mùi nhẹ, vị hơi se đắng.
3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu
Bột rễ cây cốt khí củ có màu vàng sẫm, mùi thơm, vị hơi đắng. Các cấu tử được tìm thấy trong bột rễ cây cốt khí củ: Mảnh mạch vạch, mạch mạng, mảnh bần, hạt tinh bột và sợi mô cứng.
Hình 3.1 Rễ cốt khí củ
Ghi chú: (A): Mẫu bột cốt khí củ (B): Mảnh mạch vạch (C): Mảnh mạch mạng (D): Sợi mô cứng (E): Hạt tinh bột (F): Mảnh bần
3.1.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu
Xách định sơ bộ thành phần hóa học của rễ cốt khí củ ta thu được kết quả cho thấy rễ cốt khí củ có chứa các nhóm chất: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin.