3.1.3.1 Chiết xuất cao toàn phần
Từ 1 kg bột rễ cốt khí củ chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 80 % (TT), lọc và cô trên bếp cách thủy thu được 127,69 g cao toàn phần, hiệu suất quá trình chiết 12,77 %.
3.1.3.2 Chiết xuất cao phân đoạn
Xử lý sơ bộ cao toàn phần theo quy trình sau: Cân 20 g cao toàn phần, hòa tan với 100 ml nước cất, tiến hành lắc phân bố với dung môi n – hexan sẽ tách ra làm hai phần là dịch n – hexan (màu vàng) và dịch nước (1). Phân đoạn n – hexan được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 1 (0,75 g). Dịch nước (1) tiếp tục lắc phân bố với chloroform thu được dịch chloroform (màu vàng) và phần dịch nước (2), phân đoạn chloroform được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 2 (0,99 g). Dịch nước (2) được lắc với ethyl acetat thu được dịch ethyl acetat (màu cam) và dịch nước (3), phân đoạn ethyl acetat được cô quay dưới áp suất giảm thu được cao phân đoạn 3 (3,56 g). Dịch nước (3) được cô trên bếp cách thủy thu được cao nước (5,06 g). Khối lượng cao phân đoạn được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn
Phân đoạn Cao toàn
phần n-hexan Chloroform
Ethyl
acetat Cao nước
Khối lượng (g) 20,00 0,75 0,99 3,56 5,06
Hiệu suất (%) 3,75 4,95 17,80 10,12
3.1.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
3.1.4.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Trộn đều lần lượt 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn trong 1 ml DMSO 10 % (TT) để được các dung dịch thử có nồng độ 100 mg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn, xác định hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch .
vi khuẩn và 1 vi nấm bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Kết quả cho thấy, cao toàn phần và các cao phân đoạn n – hexan, chloroform cho tín hiệu kháng khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA, MRSA và nấm mem C. albicans. Trong đó phân đoạn n – hexan cho tín hiệu kháng tốt trên chủng MSSA (22,93 mm) và C. albicans (27,32 mm), phân đoạn chloroform lại tốt trên chủng MRSA (18,93 mm). Cao ethyl acetat cho khả năng kháng khuẩn mạnh trên 2 chủng vi khuẩn MSSA (19,75 mm) và MRSA (19,28 mm), nhưng lại có vòng kháng khuẩn vừa đối với C. albicans
(13,41 mm). Cao nước cho vòng kháng khuẩn với mức độ kháng vừa với MSSA (14,95 mm) và mạnh với MRSA (15,62 mm).
Cao toàn phần và các cao phân đoạn đều không cho khả năng kháng khuẩn đối với 2 chủng vi khuẩn Gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa.
Chứng âm là DMSO 10 % (TT) không cho vòng kháng khuẩn. Ghi chú:
(1) Cao toàn phần (2) Cao n – hexan
(3) Cao chloroform
(4) Cao ethyl acetat
(5) Cao nước (6) Chứng âm DMSO 10 % (TT) 1 2 3 4 5 6 1 2 3 5 6 4
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Hình 3.9 Kết quả vòng kháng khuẩn MRSA
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Bảng 3.3 Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn (mm) Cao Vi khuẩn Vi nấm MSSA MRSA Ec Pa Ca TP 19,86 17,31 - - 16,98 n-hex 22,93 18,92 - - 27,32 CHCl3 18,45 18,93 - - 17,27 EtOAc 19,75 19,28 - - 13,41 CN 14,95 15,62 - - - Chứng âm - - - - - Ghi chú:
Ec: Escherichia coli
Pa: Pseudomonas aeruginosa
Ca: Candida albicans
(-): Không xác định được
(TP): Cao toàn phần
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
(CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(CN): Cao nước
3.1.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật
Để đánh giá chính xác về hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và các cao phân đoạn rễ cốt khí củ, chúng tôi tiến hành xác định giá trị MIC trên chủng vi khuẩn MSSA và MRSA.
Từ kết quả ở bảng 3.4, cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của cao n – hexan và cao
chloroformở chủng vi khuẩn MSSA, MRSA bằng nhau và bằng 0,45 mg/ml. Khả năng kháng vi khuẩn MSSA, MRSA của cao ethyl acetat vơi MIC bằng 0,91 mg/ml là thấp hơn so với cao n – hexan và cao chloroform. Cao toàn phần có MIC bằng 1,14 mg/ml và cao nước có MIC bằng 4,55 mg/ml.
Bảng 3.4 Kết quả MIC của cao toàn phần và các cao phân đoạn trên vi khuẩn MSSA và MRSA (mg/ml) Cao Vi khuẩn MSSA MRSA TP 1,14 1,14 n-hex 0,45 0,45 CHCl3 0,45 0,45 EtOAc 0,91 0,91 CN 4,55 4,55 Ghi chú: (TP): Cao toàn phần
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
(CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(CN): Cao nước
3.1.4.3 Xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật tự sinh đồ
Cao phân đoạn n – hexan, chloroform và ethyl acetat được hòa tan trong dung môi
chloroform, đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254, khai triển bằng hệ dung môi CHCl3
- EtOAc (11:1), sau đó phát hiện bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm. Bằng kỹ thuật hiện hình sinh học trên đối tượng MSSA, chúng tôi đã phát hiện được vết có hoạt tính kháng vi sinh vật, được thể hiện trong hình 3.11, 3.12 và 3.13.
Khi phát hiện các vết trên bản sắc ký đồ bằng cách soi UVở bước sóng 254 nm, có tất cả 4 vết được đánh số từ 1 đến 4 như hình 3.14. Giá trị Rf của các vết được trình bày ở bảng 3.5
Với phân đoạn n – hexan: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn.
Với phân đoạn ethyl acetat: Kết quả tự sinh đồ cho thấy vết số 4 (Rf = 0,80) cho vòng kháng khuẩn.
Dựa trên kết quả tự sinh đồ của cao phân đoạn n – hexan, cao chloroform và cao
ethyl acetat, chỉ có cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat cho vết kháng MSSA. Khi so với sắc ký đồ cả 3 cao đều cho 2 vết số 1 (Rf = 0,28) và vết số 3 (Rf = 0,78).
Riêng chỉ cao phân đoạn n – hexan và cao ethyl acetat, có cùng vết số 4 (Rf = 0,80). Kết luận vết số 4 (Rf = 0,80) trên sắc ký đồ cho hoạt tính kháng vi khuẩn MSSA.
1 3
Hình 3.12 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn chloroform
1 2 3 4
Bảng 3.5 Bảng kết quả giá trị Rf Vết số Rf Cao TP n-hex CHCl3 EtOAc CN 1 0,28 x x x x 2 0,65 x x 3 0,78 x x x x 4 0,80 x x 1 3 4
Hình 3.13 Kết quả tự sinh đồ cao phân đoạn ethyl acetat
1 2 3 4
TP n-hex CHCl3 Et CN
Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần, n - hexan, chloroform, ethyl acetat và cao nước.
Ghi chú :
(x) cho vết trên bản mỏng (TP): Cao toàn phần
(n – hex): Cao phân đoạn n – hexan
(CHCl3): Cao phân đoạn chloroform
(CN): Cao nước