2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Nguyên tắc phương pháp: Bơm dung dịch thử vào các giếng đã được đục lỗ. Nếu chất thử có sự ức chế vi khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh đĩa. Dựa vào đường kính đo vùng ức chế có thể đánh được khả năng kháng khuẩn của mẫu thử.
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm: Môi trường sau khi được pha và hấp khử trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm. Thể tích môi trường khoảng 20 – 25 ml/đĩa (đĩa có đường kính 90 mm). Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chuẩn bị vi sinh vật:
- Vi khuẩn: Sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở 37 °C trong 24 giờ, vi khuẩn được pha trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 625 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml.
- Nấm men được hoạt hóa trong môi trường SDA (Candida albicans) trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 37 ℃. Sau đó phân tán trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85 % và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi nấm được điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bước sóng 530 nm hoặc được pha loãng với canh thang sao cho nồng độ đục bằng thang McFarland 0,5. Giá trị này tương đương với khoảng 1 – 5 x 106
CFU/ml. Vi khuẩn, vi nấm sau khi được pha chế phải được sử dụng trong vòng 30 phút.
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 100 mg cao toàn phần và cao phân đoạn hòa tan vào trong 1 ml DMSO 10 % (TT).
Tiến hành khảo sát: Huyền dịch vi khuẩn được trải đều trên mặt thạch bằng que bông vô trùng. Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60°. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn được trải đều. Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng ống thép không rỉ. Cho vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch chất kháng khuẩn.
Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp môi trường. Ủ đĩa thạch trong tủ ấm ở 37 °C.
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ đối với vi khuẩn và 20 – 24 giờ đối với vi nấm. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng ức chế xung quanh lỗ. Đo và ghi nhận đường kính vòng ức chế bằng thước kẹp có độ chia nhỏ nhất bằng 0,01 mm. Khả năng kháng mạnh hay yếu được đánh giá sơ bộ bằng giá trị đường kính vòng ức chế theo bảng 2.4.
Bảng 2.4 Bảng đối chiếu đường kính vòng kháng vi sinh vật [29]
Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật ≥ 15 Mạnh 10 - 14 Vừa < 9 Yếu 0 Không kháng
2.2.4.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật MIC
Những mẫu cao có tác động ức chế sẽ được thử nghiệm tìm MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.
Nguyên tắc: Việc xác định MIC dựa vào phương pháp pha loãng trong môi trường rắn. Mẫu thử được pha loãng ½ liên tục trong môi trường thích hợp, sau đó cho vào một lượng vi khuẩn xác định. Sau thời gian ấp, tìm nồng độ thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [4].
Phương pháp: Pha loãng trong môi trường rắn.
Chuẩn bị dung dịch: Hòa tan chính xác lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn trong DMSO 10 % (TT) thành dung dịch mẹ. Từ dung dịch mẹ, pha loãng với môi trường MHA thành dãy có 10 nồng độ chất thử giảm dần với độ pha loãng là 2. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1. Khi sử dụng pha loãng tiếp với dung môi DMSO 10 % (TT) 10 lần để có mật độ khoảng 107 CFU/ ml.
Tiến hành khảo sát: Chấm 1 µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37 °C.
Đọc kết qua sau 16 – 18 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại.
Đọc kết quả: Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất tại đó ức chế vi sinh vật mọc lên đĩa thạch. Lặp lại 3 lần.
2.2.4.3 Kỹ thuật hiện hình sinh học
Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Nguyên tắc: Dựa vào phương pháp khuếch tán trên thạch. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.4.1.
Tiến hành SKLM mẫu cao phân đoạn n – hexan, chloroform, ethyl acetat: Chấm 2 điểm mẫu cao n – hexan, chloroform, ethyl acetat và triển khai song song trên cùng một bản mỏng trong cùng điều kiện. Sau khi triển khai 1 điểm chấm được dùng để phát hiện bằng cách soi UVở bước sóng 254 nm, xác định số vết và giá trị Rf. Điểm chấm còn lại được dùng để phát hiện vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc. Bản mỏng sau khi triển khai, đuổi hết dung môi để nguyên hoặc cắt ra thành từng mảnh và đặt trên bề mặt thạch đã có trải vi khuẩn thử nghiệm. Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp, sau đó ủ ở điều kiện thích hợp. Các vết cho hoạt tính sẽ cho vòng ức chế vi khuẩn trên bề mặt.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả
3.1.1 Khảo sát thực vật học rễ cây cốt khí củ 3.1.1.1 Mô tả hình thái 3.1.1.1 Mô tả hình thái
Rễ cốt khí củ hình trụ cong queo, vỏ sần sùi, nhăn nheo, màu nâu xám, có các đốt lồi lên chia củ thành từng gióng. Những rễ củ to được cắt thành lát mỏng 1 – 2 cm, phơi khô. Mặt cắt ngang thấy phần vỏ mỏng, phần gỗ dày. Thể chất rắn, có mùi nhẹ, vị hơi se đắng.
3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu
Bột rễ cây cốt khí củ có màu vàng sẫm, mùi thơm, vị hơi đắng. Các cấu tử được tìm thấy trong bột rễ cây cốt khí củ: Mảnh mạch vạch, mạch mạng, mảnh bần, hạt tinh bột và sợi mô cứng.
Hình 3.1 Rễ cốt khí củ
Ghi chú: (A): Mẫu bột cốt khí củ (B): Mảnh mạch vạch (C): Mảnh mạch mạng (D): Sợi mô cứng (E): Hạt tinh bột (F): Mảnh bần
3.1.1.3 Định tính sơ bộ thành phần hóa học của bột dược liệu
Xách định sơ bộ thành phần hóa học của rễ cốt khí củ ta thu được kết quả cho thấy rễ cốt khí củ có chứa các nhóm chất: Anthranoid, flavonoid, coumarin và tanin.