L ỜI MỞ ĐẦU
3.3. Kết quả xác định một số chỉ số lí hóa của tinhd ầu lá Trầu không
3.3.1. Đánh giá cảm quan
a/ Màu sắc và độ trong suốt: có màu vàng nhạt, trong suốt không bị vẫn đục.
b/ Mùi: nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không,
c/Vị: cay 3.3.2. Tỷ trọng
Bảng 3. 7: Kết quả trung bình cộng của ba lần cân ống tiêm đểđo tỷ trọng tinh dầu TB cộng Ống tiêm không(G) 2,986 2,935 3,005 2,975 Ống tiêm chứa nước cất(G1) 4,14 4,081 4,135 4,118 Ống tiêm chứa tinh dầu Trầu không(G2) 4,013 3,97 4,023 4,002
Hình 3. 1: Mẫu tinh dầu chiết được tại phòng thí nghiệm
𝑑 = 𝐺−𝐺2
𝐺−𝐺1 = 2,975−4,0022,975−4,118 = 0,898
G: Khối lượng của ống tiêm không, (g). G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g). G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g).
3.4. Kết quảđịnh tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu tinh dầu Trầu không khảo sát, tôi tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.8 Kết quả ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3. 8: Kết quảđịnh tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Thí nghiệm Kết quả Kếtluận
1.Định tính Ankaloid Thuốc thử Wagner - 2.Định tính Flavonoids Thử nghiệm NaOH 10% +
Thử nghiệm FeCl3 + 3.Định tính Anthraquinones Phản ứng Bomtra eger + 4.Định tính Steroid Thử nghiệm H2SO4đđ + 5.Định tính Saponin Thử nghiệm 1: + Thử nghiệm 2: + 6.Định tính Tanin
Thử nghiệm FeCl3
+
Nhận xét:Từ 6 thử nghiệm khảo sát định tính như trình bày, có 5 thử nghiệm có kết quả dương tính: Flavonoids; Anthraquinones; Steroid; Saponin; Tanin. Theo nghiên cứu của Nguyễn Nho Dũng (2011) thì dịchchiết lá trầu có chứa Ankaloid, nhưng theo nghiên cứu ở trên không có. Nguyên nhân có thể là do khác giống, khác điều kiện canh tác, đất đai, thời tiết nên dẫn đến kết quả không có sự giống nhau.
3.5. Kết quảxác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức:
η = 𝑉𝑇𝐷 .𝑑𝑇𝐷
𝑚𝑁𝐿 = 1,5 .1,046500 = 0,27%
Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%) 𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)
𝑑𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)
3.6. Kết quảxác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS
3.6.1. Sắc ký đồ tinh dầu lá Trầu không
Nhận xét: Qua kết quả trên sắc ký đồ, tôi nhận thấy có 18 giá trị có thời gian lưu khác nhau, điều đó có nghĩa trong mẫu tinh dầu lá Trầu không thu được có chứa 18 cấu tử, ứng với 18 hợp chất. Các cấu tửở những điểm peak: 14,994; 28,801; 21,47 có thời gian lưu cách xa nhau và có cường độtương đối lớn, chứng tỏ đây là những cấu tử có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu. Các cấu tử còn lại có cường độ tương đối thấp nên có hàm lượng không đáng kể trong tinh dầu lá Trầu không. Cũng có một số cấu tử có thời gian lưu rất gần nhau, chúng có thểlà đồng phân của nhau như các cấu tửở peak: 21,592; 21,792.
3.6.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu không
Bảng 3. 9: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu không
TT RT Tên chất lượHàm ng Mass
Độtương hợp khối phổ 1 5.079 -Pinene 0.629 136 945 2 6.840 Eucalyptol 0.642 154 941 3 7.093 β-Ocimene 0.493 136 952 4 8.212 Linalool 0.323 154 928 5 11.899 p-Allylphenol 0.755 134 911 6 14.289 Chavicol, acetate 2.337 176 957 7 14.994 Eugenol 33.142 164 938 8 15.198 -Copaene 0.334 204 915 9 15.563 β-Elemen 0.655 204 909 10 15.736 Methyleugenol 0.274 178 923 11 16.314 Caryophyllene 3.118 204 948 12 17.140 Humulene 0.794 204 943 13 17.653 -Muurolene 2.159 204 938 14 17.802 Germacrene D 5.017 204 942 15 18.172 (+)-Bicyclogermacrene 3.041 204 910 16 18.351 β-Bisabolene 0.672 204 823 17 18.800 Aceteugenol 28.801 206 918 18 18.920 (E)--Bisabolene 0.256 204 902 19 20.233 (-)-Globulol 0.381 222 915 20 20.425 (+)-Viridiflorol 0.375 222 905 21 20.637 Rosifoliol 0.166 222 858 22 21.207 1,10-Diepicubenol 0.178 222 856 23 21.470 2-(Acetyloxy)-4- allylphenyl acetate 14.749 234 901 24 21.592 -Cadinol 0.167 222 899 25 21.792 -Cadinol 0.543 222 911
Nhận xét: Theo bảng phân tích thành phần hóa học của mẫu tinh dầu lá Trầu không cho thấy có tổng cộng 25 cấu tửđược định danh, nhưng ở sắc ký đồ chỉ thể hiện 18 điểm peak có tên trên biểu đồ. Có lẽnguyên nhân là do điểm peak của các cấu tử còn lại có cường độ quá thấp nên không thể hiện được tên của các cấu tử lên biểu đồ. Kết quả bảng phân tích cho thấy thành phần tinh dầu của lá Trầu không tại Châu Đức, TP.Bà Rịa gồm 25 cấu tử và thành phần chính chủ yếu là: Eugenol chiếm 33,142%; Aceteugenol chiếm
28,801%; 2-(Axetyloxy)-4-allylphenyl acetate chiếm 14,749%; Germacrene D chiếm 5,017%; Caryophyllene chiếm 3,118%; (+)-Bicyclogermacrene chiếm 3,041%; Chavicol,acetate chiếm 2,337%; 𝛾-Muurolene chiếm 2,159%.
Kết quả chạy sắc ký phổ cho thấy diện tích peak của Eugenol có diện tích lớn nhất, vì vậy trong mẫu tinh dầu thì Eugenol là thành phần chủ yếu.
3.6.3. So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa với một sốvùng khác đã công bốở Việt Nam thành phố Bà Rịa với một sốvùng khác đã công bốở Việt Nam
Sau khi có kết quả thành phần hóa học tinh dầu Trầu không ở Châu Đức, Tp. Bà rịa tôi tiến hành so sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu không với các vùng khác đã công bốở Việt Nam. Thành phần tinh dầu ở Châu Đức, Tp. Bà rịa có 25 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang có trên 8 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Quãng Nam có 49 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh có 51 cấu tử và thành phần các cấu tửđược trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3. 10: So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng khác ở Việt Nam STT Hợp chất Hàm lượng % I II III IV 1 Eugenol 33,142 - - - 2 Methyleugenol 0,274 34,55 8,34 6,31 3 Aceteugenol 28,801 20,14 16,55 13,68 4 Germacrene D 5,017 - 5,21 4,12 5 𝛾-Muurolene 2,159 1,33 - - 6 𝛼-Cadiol 0,543 5,51 - -
Trong đó: (I) Trầu ởChâu Đức, Tp.BR, (II) Trầu ở Hậu Giang [3], (III) Trầu ở Quãng Nam [1], (IV) Trầu ở Hóc Môn, Tp.HCM [1]
Nhận xét: Đối chiếu thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng khác ở Việt Nam tôi nhận thấy có sự khác nhau về các hợp chất trong bốn tinh dầu ở các vùng khác nhau. Trong khi hợp chất chủ yếu của tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức là Eugenol (33,142%) thì Methyleugenol (35,55%) là thành phần chiếm hàm lượng cao nhất trong tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang; và ở Quãng Nam với Hồ Chí Minh thì Aceteugenol lại chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là: 16,55% và 13,68%. Có sự
khác nhau trên có thểlà do điều kiện khí hậu, thỗnhưỡng và phương pháp trích ly tinh dầu. Ngoài ba hợp chất chính của Eugenol thì còn có ba hợp chất nữa là: Germacrene D, 𝛾-Muurolene, 𝛼-Cadiol, chứng tỏ tinh dầu tách chiết được ở phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu đem phân tích tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam chính là tinh dầu Trầu không.
3.7. Kết quảxác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn đo đường kính vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3. 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm)
STT Nồng độ µl/ml B. cereus E. coli S. typhi S. areus P. aeruginosa 1 1024 8,33±1,11 3,00±0,00 3,5±0,5 4,33±1,11 5,33±2,44 2 512 5,33±1,55 2,67±0,44 2,5±0,5 2,33±0,44 3,00±0,0 3 256 5,00±1,00 1,00±0,00 - 2,33±0,44 1,00±0,00 4 128 4,00±0,67 - - 1,3±1,00 - 5 Tetracyclin 2,67±0,89 4,00±0,00 5,00±0,00 8,00±0,00 6,00 ±0,00 6 Ampicilin 7,33±0,44 4,00±0,00 - - 2,00±0,00 7 Amoxycilin - - - - 3,00±0,00 8 DMSO 2% + TWEEN 80 0,2% - - - - -
Theo bảng 3.8 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không trên từng chủng vi khuẩn tôi rút ra một số nhận xét như sau:
1024 µl/ml có hoạt tính kháng khuẩncao nhất với kết quả là 8,33±1,11mm, hai nồng độ 512µl/ml và 256µl/ml không chênh lệch đáng kể kết quả lần lượt là 5,33±1,55 mm và 5,00±1,00mm. Nồng độ còn lại là 128µl/ml kết quả thu được là 4,00±0,67mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu khôngđối với chủng B. cereus tương đối cao, nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng độ thấp. Hình 3. 3: Khảnăng kháng B. cereus của tinh dầu lá Trầu không (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): Tetracyclin, (6): Ampicilin, (7): DMSO 2% + Tween 80 0,2%
Trên chủng vi khuẩn E. coli, sau khi tiến hành khảo sát thì nhận thấy ở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml khả năng kháng khuẩn không chênh lệch nhiều, chỉ ở mức 3,00±0,00mm và 2,67±0,44 mm. Nồng độ 256µl/ml khả năng kháng chỉ đạt 1,00±0,00mm và không kháng ở nồng độ 128µl/ml. Qua kết quả cho thấy, hoạt tính kháng vi khuẩn E. colicủa tinh dầu lá Trầu không rất thấp so với các chủng vi khuẩn còn lại.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. typhi, sau khi tiến hành khảo sát ta nhận thấy tinh dầu lá Trầu không chỉ kháng được vi khuẩn S. typhiở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml, kết quả lần lượt là: 3,5±0,5mm và 2,5±0,5mm. Còn ở nồng độ 256µl/ml và 128µl/ml thì không có khả năng kháng S. typhi. Như vậy, qua kết quả cho thấy khả năng kháng vi khuẩn S. typhi của tinh dầu lá Trầu không cũng rất kém.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. aureus, các nồng độ khảo sát giảm dần vòng kháng khuẩn lần lượt là: 1024 µl/ml ứng với 4,33±1,11mm, 512 µl/ml và 256 µl/ml có cùng vòng kháng là 2,33±0,44mm, 128 µl/ml ứng với 1,3±1,00mm. Qua kết quả cho thấy, khảnăng kháng vi khuẩn S. aureus của tinh dầu lá Trầu không thấp hơn B. cereus, nhưng cao hơn cả E. coli
và S. typhi.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Hình 3. 6: Khảnăng kháng S. aureus của tinh dầu lá Trầu không Hình 3. 5: Khảnăng kháng S. typhi của tinh dầu lá Trầu không
Trên chủng vi khuẩn P. aeruginosa có sựthay đổi vòng kháng rõ rệt hơn khi thay đổi nồng độ từcao đến thấp. Ở nồng độ cao nhất là 1024 µl/ml thì vòng kháng tương ứng là 5,33±2,44mm, nồng độ giảm xuống 512 µl/ml thì vòng kháng còn 3,00±0,0mm, nồng độ giảm thêm còn 256 µl/ml thì vòng kháng chỉ còn 1,00±0,0mm; nồng độ thấp nhất 128 µl/ml thì hoàn toàn không kháng được P. aeruginosa.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Dựa trên kết quả thí nghiệm với DMSO 2% + Tween 80 0,2%, các mẫu chứng âm không xuất hiện vòng kháng khuẩn, điều này được khẳng định khi đa số các thí nghiệm về kháng khuẩn đều dùng DMSO làm chứng âm [10]. DMSO và Tween 80 dùng để phân tách tinh dầu ra nhỏ hơn để dễ dàng khuếch tán vào đĩa giấy. Vì vậy có thể kết luận rằng DMSO hòa tan đa số các hợp chất và sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh hưởng đến kết quả kháng khuẩn [12].
- Tinh dầu Trầu không có khảnăng kháng được 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu thử nghiệm. Hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu không tốt nhất trên chủng B. cereus và thấp nhất trên chủng E. coli và S. typhi. Đối với S. aureus và P. aeruginosa mức độ kháng không cao so với B. cereus. Ở nồng độ thấp nhất (128µl/ml) thì hầu như không kháng được cả 3 chủng E. coli, S. typhi và P. aeruginosa; có kháng ở B. cereus và S. areus lần lượt là 4,00±0,67mm và 1,3,00±0,0mm.
-Ở nồng độ 1024µl/ml, hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu không thấp hơn Tetracyclin mức 30µg, tương đương với Ampicilin mức 10µg và cao hơn Amoxylin mức 10µg.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu tinh dầu lá Trầu không, tôi rút ra được một số kết luận sau:
- Qua quá trình thực nghiệm tôi đã xây dựng quy trình trích ly tinh dầu lá Trầu không kết hợp với các điều kiện thích hợp nhằm thu được lượng tinh dầu cao nhất như sau:
Tỷ lệnước/nguyên liệu 4/1 (v/w)
Thời gian ngâm 90 phút
Thời gian chưng cất 270 phút Tỷ lệ khối lượng tinh dầu lá Trầu không 0,27% (w/w)
- Bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã tách được tinh dầu lá Trầu không. Tinh dầu là một chất lỏng, có màu vàng nhạt, nhẹhơn nước và có tỷ trọng là 0,898g/cm3, mùi nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không và vị cay.
- Dịch chiết lá Trầu không có chứa Flavonoid, Steroid, Anthraquinone, Saponin, Tanin.
- Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổGC/MS đã xác định được 25 cấu tử chính có trong tinh dầu. Trong thành phần chính của lá Trầu không là hợp chất Eugenol chiếm 33,142%.
- Kết quả khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng vi khuẩn được thử nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 1024µl/ml đạt đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở 5 loại chủng vi khuẩn và ở nồng độ thấp nhất 128µl/ml thì tinh dầu lá Trầu không chỉ còn hoạt tính đối với B. cereus và S. areus, 3 chủng còn lại ở nồng độ thấp này không có hoạt tính kháng. Ngoài ra, ở nồng độ 1024µl/ml nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khảnăng kháng tốt hơn kháng sinh Amoxylin và tươngđương với Ampicilin, vẫn thấp hơn so với Tetracyclin.
4.2. Kiến nghị
-Các giống Trầu không ở nhiều nơi khác, điều kiện đất canh tác, mùa khô và mùa mưa, phương pháp bảo quản lá Trầu không ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và thành phần của tinh dầu.
-Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần các chất có trong thân, rễ và hoa của Trầu không, so sánh với thành phần các chất có trong lá Trầu không. Từđó chọn ra nguồn nguyên liệu tối ưu nhất nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học để phục vụ cho ngành y học.
-Áp dụng các phương pháp mới vào quá trình trích ly như: chưng cất bằng nước muối NaCl, chưng cất bằng nước kết hợp với vi sóng, …
-Xác định tính chất vật lý khác của tinh dầu như: độ khúc xạ ánh sáng, góc quay cực.
-Xác định chỉ số hóa học của tinh dầu như: chỉ số acid, chỉ số este, chỉ số xà phòng hóa.
-Tìm hiểu thêm về quá trình làm sạch và tinh chế tinh dầu.
-Thử nghiệm thêm một số vi khuẩn khác đểđo độ kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
-Xác định khảnăng chống oxi hóa của tinh dầu lá Trầu không.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Nguyễn Nho Dũng, “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu và dịch chiết từ lá Trầu không”, Tóm tắt luận văn Thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng – 2011.