tích trình tự ITS
Để phân loại đến loài, trình tự ITS đã được khuếch đại và phân tích về độ tương đồng trình tự với các trình tự trên cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng công cụ BLAST. Ở hình 3.9, các sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS có băng sáng, rõ nét với kích thước khoảng 550 - 600 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi đến First BASE Laboratories Sdn. Bhd. (Malaysia) để giải trình tự.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel agarose 1,0%.
Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm Phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF6 có độ tương đồng cao với các chủng vi nấm Neofusicoccum italicum MFLUCC 15-0900 (99,17%), N. ningerense CGMCC 3.20078 (97,69%) và N. magniconidium CGMCC 3.20077 (97,5%) (Bảng 3.2). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy, chủng TQF6 có quan hệ gần với các chủng thuộc loài N. italicum (Hình 3.10). Dựa vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, đặc điểm bào tử và phân tích trình tự gen ITS, chủng TQF6 được định danh là Neofusicoccum italicum
TQF6. Neofusicoccum là chi nấm thuộc họ Botryosphaeriaceae sinh trưởng ở mạch gỗ và gây bệnh đóng vảy và chết ở các cây thân gỗ trên toàn thế giới,
40
đặc biệt cây nho và bạch đàn. Chất neofusnaphthoquinone B thuộc nhóm naphthoquinone tách chiết từ vi nấm Neofusicoccum australe có hoạt tính ức chế MRSA mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 16 µg/mL [69]. Ngoài ra, một số các hợp chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh, kháng tế bào ung thư, chống tăng sinh tế bào ung thư máu đã được tách chiết từ dịch lên men chủng N. australe như myrtucommulones, naphthalenones, cyclobotryoxides, Melleins [70]. Tuy nhiên, các chất gây độc tế bào ung thư từ chủng N. australe có hoạt tính thấp và chưa có nghiên cứu khả năng sinh paclitaxel của loài này.
Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF25 có độ tương đồng thấp với các chủng nấm tham khảo thuộc chi Hypoxylon:
H. griseobrunneum CBS 331.73 (91,22%), H. liviae CBS 115282 (87,61%) và H. papillatum ATCC 58729 (87,3%). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy, chủng vi nấm H. griseobrunneum và H. liviae CBS 115282 tạo nhóm riêng biệt với chủng TQF25 (Bảng 3.3; Hình. 3.10). Do vậy, chủng TQF25 được định danh là Hypoxylon sp. TQF25. Chi Hypoxylon thuộc ngành Ascomycota được nhà sinh vật học Carlos Spegazzini phát hiện vào từ năm 1880 – 1922.
Hypoxylon là chi lớn nhất với hơn 200 loài được định danh. Do vậy, để phân loại đến loài cần những nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái như: bào tử ngoài, thành bào tử, sắc tố, khe mầm. Kết hợp với đặc điểm hình thái, phương pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự gen β-tubulin cần được bổ sung bên cạnh trình tự ITS [71]. Hypoxylon được biết đến với khả năng sản xuất một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học như kháng nấm, gây độc tế bào, tiêu diệt côn trùng, kháng khuẩn và các hợp chất phytotoxic [72]. Bốn hợp chất azaphilones mới là ultiformins A-D phân lập từ H. multiforme được báo cáo có khả năng kháng khuẩn rất mạnh. Năm 2007, hai chất mới daldinone A và C được tách chiết từ H. truncatum IFB-18 phân lập từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư SW1116 với giá trị MIC đạt 49.5 và 41 µM. Hiện chưa có công bố nào đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 và A-549 cũng như sinh paclitaxel từ chi trên. Do chủng nấm TQF25 chứa 2 gen chính tham gia sinh tổng hợp paclitaxel nên đánh giá khả năng sinh paclitaxel là hướng đi đầy hứa hẹn trong tương lai.
41
Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với các chủng tham chiếu
Chủng TQF6 N. italicum MFLUCC 15-0900 (NR_168164) N. microconidium CGMCC 3.18750 (NR_161003) N. ningerense CGMCC 3.20078 (NR_172860) N. magniconidium CGMCC 3.20077 (NR_172859) N. grevilleae CPC 16999 (NR_168143) TQF6 100,00 97,26 97,12 98,06 97,86 97,70 N. italicum MFLUCC 15-0900 (NR_168164) 97,26 100,00 94,76 95,67 95,47 94,86 N. microconidium CGMCC 3.18750 (NR_161003) 97,12 94,76 100,00 98,38 98,02 96,95 N. ningerense CGMCC 3.20078 (NR_172860) 98,06 95,67 98,38 100,00 99,64 96,75 N. magniconidium CGMCC 3.20077 (NR_172859) 97,86 95,47 98,02 99,64 100,00 96,38 N. grevilleae CPC 16999 (NR_168143) 97,70 94,86 96,95 96,75 96,38 100,00
42
Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với các chủng tham chiếu
Chủng TQF25 H. griseobrunneum CBS 331.73 (NR_155184) H. bellicolor UCH 9543 (NR_169971) H. neosublenormandii MFLU 15-1193 (NR_155174) H. liviae CBS 115282 (NR155154) H. papillatum ATCC 58729 (NR155153) TQF25 100,00 84,02 75,20 75,47 78,11 76,76 H. griseobrunneum CBS 331.73 (NR_155184) 84,02 100 77,69 79,07 80,40 81,72 H. bellicolor UCH 9543 (NR_169971) 75,2 77,69 100 81,35 81,79 82,19 H. neosublenormandii MFLU 15-1193 (NR_155174) 75,47 79,07 81,35 100 77,03 79,06 H. liviae CBS 115282 (NR_155154) 78,11 80,40 81,79 77,03 100 85,97 H. papillatum ATCC 58729 (NR_155153) 76,76 81,72 82,19 79,06 85,97 100
43
Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với các chủng tham chiếu
Chủng TDF6 F. foetens CBS 110286 (NR_15986) F. inflexum NRRL 20433 (NR_152941) F. bactridioides CBS 100057 (NR_120262) F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263) F. pseudocircinatum CBS 449.97 (NR_163683) TDF6 100,00 99,58 98,92 98,95 99,16 98,92 F. foetens CBS 110286 (NR_159865) 99,58 100,00 95,99 95,69 95,88 95,59 F. inflexum NRRL 20433 (NR_152941) 98,92 95,99 100,00 98,46 98,65 98,40 F. bactridioides CBS 100057 (NR_120262) 98,95 95,69 98,46 100,00 99,82 99,60 F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263) 99,16 95,88 98,65 99,82 100,00 99,80 F. pseudocircinatum CBS 449.97 (NR_163683) 98,92 95,59 98,40 99,60 99,80 100,00
44
Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với các chủng tham chiếu
Chủng TDF7 F. foetens CBS 110286 (NR_15985) F. inflexum NRRL 20433 (NR_152941) F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (NR_163682) F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263) F. bactridioides CBS 100057 (NR_120262) TDF7 100,00 92,95 89,92 88,91 87,96 87,80 F. foetens CBS 110286 (NR_159865) 92,95 100,00 95,99 95,50 95,88 95,69 F. inflexum NRRL 20433 (NR_152941) 89,92 95,99 100,00 98,27 98,65 98,46 F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (NR_163682) 88,91 95,50 98,27 100,00 99,63 99,45 F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263) 87,96 95,88 98,65 99,63 100,00 99,82 F. bactridioides CBS 100057 (NR_120262) 87,80 95,69 98,46 99,45 99,82 100,00
45
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2 với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628).
Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS từ chủng TDF6 và TDF7 cho băng điện di sắc nét có kích thước khoảng 550 bp (Hình 3.9). So sánh trình tự gen ITS của chủng TDF6 với các gen tham chiếu trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) cho thấy, chủng TDF6 thể hiện độ tương đồng cao với các chủng nấm
Fusarium foetens CBS 110286 (99,58%), F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (99,36%) và F. circinatum CBS 405.97 (98,74%) (Bảng 3.4). Tương tự, chủng TDF7 có độ tương đồng cao với các chủng nấm Fusarium foetens CBS 110286 (99,59%), F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (98,00%) và F. circinatum CBS 405.97 (98,37%) (Bảng 3.5). Cây phát sinh loài khẳng định
46
chủng TDF6 và TDF7 thuộc cùng nhóm (Hình. 3.10). Kết hợp đặc điểm hình thái so với với các công bố trước đây và trình tự ITS, chủng nấm TDF6, TDF7 được phân loại thuộc loài Fusarium foetens. Năm 2016, Vasundhara đã báo cáo hoạt tính chống oxy hóa và ức chế sư phát triển của tế bào của chủng
F. tricinctum T6 phân lập từ cây thông đỏ (T. tabaca L. subsp. wallichiana (Zucc.) Pilger) tại Ấn Độ. Chủng F. tricinctum T6 cho thấy sự ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF-7 và HeLa với giá trị IC 50 của dịch chiết nấm lần lượt là 225 ± 26 và 220 ± 18 μg/L đối với các dòng tế bào MCF-7 và HeLa. Hơn nữa, F. tricinctum thể hiện hoạt tính chống oxy hóa với giá trị IC 50 là 482 ± 9 μg/mL [52]. Năm 2015, Zaiyou và cộng sự đã phân lập được 435 chủng vi nấm nội sinh từ cây T. wallichiana
var. mairei. Trong đó, chỉ có một chủng duy nhất thuộc chi Fusarium có khả năng sản xuất paclitaxel. Năng suất paclitaxel trong toàn bộ môi trường nuôi cấy PDB và trong môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng từ chủng này lần lượt là 0,0153 mg/L và 0,0119 mg/L. Hàm lượng paclitaxel trong sợi nấm khô là 0,27 mg/kg. Các kết quả này cho thấy tiềm năng sản xuất paclitaxel từ các chủng Fusarium nói chung và chủng Fusarium foetens TDF7 nói riêng là rất lớn [73]. Fusarium foetens được biết đến là loài nấm gây bệnh héo lá trên cây hải đường (Begonia hiemalis) và đã được phát hiện trên Begonia ở Canada, Mỹ, Nhật Bản, Hà Lan, Đức và Na Uy. F. foetens chưa được báo cáo nhiều về khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư, tuy nhiên các chất có hoạt chất sinh học được phân lập từ các loài khác thuộc chi
47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ 25 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T. chinesis) thu thập tại Hà Giang, đã sàng lọc được 12/25 (chiếm 48%) chủng có khả năng kháng VSV kiểm định. Tuyển chọn được 4 chủng nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 có khả năng kháng 5 chủng VSV kiểm định.
Chủng TDF7 ức chế mạnh nhất với tế bào ung thư phổi A549 và MCF- 7 với tỷ lệ ức chế tế bào đạt 93,91 ± 2,18% và 89,22 ± 4,09. Tỷ lệ ức chế tế bào tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 của chủng TDF6 đạt lần lượt 92,65 ± 1,4% và 77,15 ± 1,98%.
Cả 4 chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 đều có hoạt tính chống oxy hóa cao. Tại nồng độ 400 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH của TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 lần lượt là 93,78; 93,49; 89,15 và 60,71%.
Đánh giá khả năng sinh paclitaxel của 4 chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 bằng chỉ thị phân tử cho thấy chủng TQF25 mang hai gen dbat
và bapt, chủng TQF6 và TDF6 chỉ mang gen dbat; gen dbat, bapt và ts
không được khuếch đại ở chủng TDF7.
Kết hợp đặc điểm hình thái, bào tử và phân tích trình tự gen ITS, các chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 được định danh lần lượt là
Neofusicoccum italicum TQF6, Hypoxylon sp. TQF25, Fusarium foetens TDF6 và Fusarium foetens TDF7.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng sinh và ức chế tế bào ung thư từ 4 chủng vi nấm TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7.
Tách chiết và phân tích cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dịch lên men 4 chủng vi nấm.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bano, N., I.F. Rizvi, N. Sharma, M.H. Siddiqui, M. Kalim, A. Khan, and S. Akhtar, 2016, Production of bioactive secondary metabolites from endophytic fungi, International Research Journal of Engineering and Technology, 3(6), pp. 11-21.
2. Daisy, B.H., G.A. Strobel, U. Castillo, D. Ezra, J. Sears, D.K. Weaver, and J.B. Runyon, 2002, Naphthalene, an insect repellent, is produced by Muscodor vitigenus, a novel endophytic fungus, Microbiology, 148(11), pp. 3737-3741.
3. Schulz, B. and C. Boyle, 2005, The endophytic continuum,
Mycological Research, 109(6), pp. 661-686.
4. Arnold, A.E., L.C. Mejía, D. Kyllo, E.I. Rojas, Z. Maynard, N. Robbins, and E.A. Herre, 2003, Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree, Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(26), pp. 15649-15654.
5. Howitz, K.T. and D.A. Sinclair, 2008, Xenohormesis: sensing the chemical cues of other species, Cell, 133(3), pp. 387-391.
6. Wu, Y.-Y., T.-Y. Zhang, M.-Y. Zhang, J. Cheng, and Y.-X. Zhang, 2018, An endophytic Fungi of Ginkgo biloba L. produces antimicrobial metabolites as potential inhibitors of FtsZ of Staphylococcus aureus,
Fitoterapia, 128(pp. 265-271.
7. Hawksworth, D.L., 2001, The magnitude of fungal diversity: the 1· 5 million species estimate revisited, Mycological Research, 105(12), pp. 1422-1432.
8. Schulz, B., C. Boyle, S. Draeger, A.-K. Römmert, and K. Krohn, 2002, Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites, Mycological Research, 106(9), pp. 996-1004.
9. Huang, W., Y. Cai, K. Hyde, H. Corke, and M. Sun, 2008, Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants, Fungal diversity, pp. 11-19.
10. Dreyfuss, M. and I.H. Chapela, Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight pharmaceuticals, in Discovery of Novel Natural Products with Therapeutic Potential. 1994. p. 49-80.
49
11. Aly, A.H., R. Edrada-Ebel, I.D. Indriani, V. Wray, W.E. Müller, F. Totzke, U. Zirrgiebel, C. Schächtele, M.H. Kubbutat, and W. Lin, 2008, Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte Alternaria sp. and their subsequent detection in its host plant Polygonum senegalense,
Journal of Natural Products, 71(6), pp. 972-980.
12. Ibrahim, S.R., H.M. Abdallah, E.S. Elkhayat, N.M. Al Musayeib, H.Z. Asfour, M.F. Zayed, and G.A. Mohamed, 2018, Fusaripeptide A: new antifungal and anti-malarial cyclodepsipeptide from the endophytic fungus Fusarium sp, Journal of Asian Natural Products Research, 20(1), pp. 75-85.
13. Strobel, G. and B. Daisy, 2003, Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), pp. 491-502.
14. Li, J.Y. and G.A. Strobel, 2001, Jesterone and hydroxy-jesterone antioomycete cyclohexenone epoxides from the endophytic fungus
Pestalotiopsis jesteri, Phytochemistry, 57(2), pp. 261-265.
15. Lugtenberg, B.J., J.R. Caradus, and L.J. Johnson, 2016, Fungal endophytes for sustainable crop production, FEMS Microbiology Ecology, 92(12), pp. 88-94.
16. Demain, A.L., 2000, Microbial natural products: a past with a future,
Special publication-royal society of chemistry, 257(pp. 3-16.
17. Berardo, C., I.M. Bulai, E. Venturino, P. Baptista, and T. Gomes, 2018, Modeling the endophytic fungus Epicoccum nigrum action to fight the “olive knot” disease caused by Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) bacteria in Olea europaea L. Trees, Trends in Biomathematics: Modeling, Optimization Computational Problems, pp. 189-207.
18. Tayung, K., B. Barik, D. Jha, and D. Deka, 2011, Identification and characterization of antimicrobial metabolite from an endophytic fungus, Fusarium solani isolated from bark of Himalayan yew,
Mycosphere, Journal of Fungal Biology, 2(3), pp. 203-213.
19. Rao, H.Y. and S. Satish, 2015, Genomic and chromatographic approach for the discovery of polyketide antimicrobial metabolites from an endophytic Phomopsis liquidambaris CBR-18, Frontiers in Life Science, 8(2), pp. 200-207.
50
20. Tawfik, N., R. Abdo, G. Abbott, U.R. Abdelmohsen, R. Edrada-Ebel, and E. Haggag, 2017, Metabolomics and Bioactivity Guided Isolation of Secondary Metabolites from the Endophytic Fungus Chaetomium sp,
Journal of Advanced Pharmacy Research, 1(1), pp. 66-74.
21. Ma, Y.-m., K. Qiao, Y. Kong, M.-y. Li, L.-x. Guo, Z. Miao, and C. Fan, 2017, A new isoquinolone alkaloid from an endophytic fungus R22 of Nerium indicum, Natural Product Research, 31(8), pp. 951-958. 22. Lai, D., A. Wang, Y. Cao, K. Zhou, Z. Mao, X. Dong, J. Tian, D. Xu, J. Dai, and Y. Peng, 2016, Bioactive dibenzo-α-pyrone derivatives from the endophytic fungus Rhizopycnis vagum Nitaf22, Journal of Natural Products, 79(8), pp. 2022-2031.
23. Wu, L.-S., M. Jia, L. Chen, B. Zhu, H.-X. Dong, J.-P. Si, W. Peng, and T. Han, 2016, Cytotoxic and antifungal constituents isolated from the metabolites of endophytic fungus DO14 from Dendrobium officinale,
Molecules, 21(1), pp. 14-21.
24. Xie, S. and J. Zhou, 2017, Harnessing plant biodiversity for the discovery of novel anticancer drugs targeting microtubules, Frontiers in plant science, 8(pp. 720-727.
25. Stierle, A., G. Strobel, and D. Stierle, 1993, Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew, Science, 260(5105), pp. 214-216.
26. Puri, S.C., A. Nazir, R. Chawla, R. Arora, S. Riyaz-ul-Hasan, T. Amna, B. Ahmed, V. Verma, S. Singh, and R. Sagar, 2006, The endophytic fungus Trametes hirsuta as a novel alternative source of podophyllotoxin and related aryl tetralin lignans, Journal of Biotechnology, 122(4), pp. 494-510.
27. Jiao, R.H., S. Xu, J.Y. Liu, H.M. Ge, H. Ding, C. Xu, H.L. Zhu, and R.X. Tan, 2006, Chaetominine, a cytotoxic alkaloid produced by endophytic Chaetomium sp. IFB-E015, Organic Letters, 8(25), pp. 5709-5712.
28. Guo, B., J.-R. Dai, S. Ng, Y. Huang, C. Leong, W. Ong, and B.K. Carté, 2000, Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species,