SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM
Trong thập kỷ qua, đa số các nghiên cứu vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tập trung phân lập, sàng lọc paclitaxel và thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là chi phí cao, đòi hỏi thời gian dài và tỷ lệ sàng lọc được chủng vi nấm paclitaxel thấp. Gần đây, sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen bằng Sanger và thế hệ mới (next generation of sequencing-NGS) đã hỗ trợ đắc lực trong việc sàng lọc các chủng nấm tiềm năng sinh paclitaxel. Hơn nữa, cơ chế chuyển gen ngang được chứng minh là nguyên nhân chính dẫn tới khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Chính vì vậy, các gen mã hóa enzym tham gia chính trong con đường sinh tổng hợp
34
paclitaxel, chẳng hạn như taxadiene synthase (ts), 10 deacetylbaccatin III- 10- O-acetyl transferase (dbat) và C-13 phenylpropanoid-CoA acyltransferase (bapt) được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhằm sàng lọc các chủng vi nấm tiềm năng. Trong nghiên cứu này, 4 chủng vi nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 sinh chất ức chế vi sinh vật kiểm định và tế bào ung thư cao được đánh giá khả năng sinh paclitaxel bằng chỉ thị phân tử.
Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ).
DNA tổng số của 4 chủng tuyển chọn được tách bằng bộ kit DNeasy Plant Mini cho băng DNA tổng số sắc nét trên gel agarose (Hình 3.5) và đủ nồng độ DNA thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 3 gen dbat, bapt, ts. Sản phẩm PCR có kích thước đạt 550 bp, 500 bp và 450 bp được dự đoán tương ứng với kích thước mong đợt của gen dbat, bapt và ts. Kết quả âm tính ghi nhận cho sản phẩm PCR không xuất hiện băng và có dải băng không đúng với kích thước dự đoán.
Kết quả hình 3.6 cho thấy, gen dbat với kích thước 550 được khuếch đại thành công ở 3 chủng vi nấm TQF6, TQF25 và TDF6. Gen dbat mã hoá 10-deacetyl-baccatin III-10-O-acetyltransferase tham gia xúc tác chuyển hoá 10-deacetyl baccatin III thành baccatin III, tiền chất quan trọng để sinh tổng hợp paclitaxel ở cây thông đỏ.
35
Bên cạnh gen dbat, gen bapt với kích thước 500 bp cũng được khuếch đại thành công ở chủng TQF25 (Hình 3.6). Với 2 gen chính tham gia con đường sinh tổng hợp paclitaxel xuất hiện trên chromosome, chủng TQF25 nhiều khả năng sinh tổng hợp paclitaxel. Đối với chủng TDF7, không có gen mã hoá dbat, bapt và ts được khuếch đại. Điều này khẳng định chủng này không sinh paclitaxel nhưng vẫn có tiềm năng khai thác các chất kháng sinh và kháng ung thư mới. Trong những nghiên cứu xa hơn, tối ưu môi trường, điều kiện lên men và quy trình tách chiết paclitaxel là cần thiết để khẳng định khả năng sinh paclitaxel của 3 chủng TQF6, TQF25 và TDF6.
Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh tổng hợp
paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm.
36
Trong những năm gần đây, ngày càng nhiều nghiên cứu tập trung sàng lọc các chủng vi nấm tiềm năng sinh paclitaxel bằng sử dụng các chỉ thị phân tử. Trong tổng số 19 gen mã hoá enzym tham gia sinh tổng hợp paclitaxel, các gen ts, dbat, và bapt được chú ý hơn cả. Poopa và cộng sự đã phân lập được 43 loài nấm nội sinh từ cây Salacia oblonga - một loài cây bụi thân gỗ nhiệt đới ở Ấn Độ. Trong số đó, có 7 chủng cho kết quả dương tính với gen
dbat, trong khi đó chỉ có một chủng dương tính với bapt. Xiong và cộng sự (2013) đã thiết kế chỉ thị phân tử bapt nhằm sàng lọc vi nấm sinh paclitaxel trên cây thông đỏ Anglojap (T. x media) [68]. Trên tổng số 11 chủng vi nấm, 3 chủng vi nấm chứa gen bapt có kích thước 530 bp. Năm 2020, El-Bialy và cộng sự đã khuếch đại thành công gen bapt với kích thước 582 bp từ
Acremonium sp. KM 677335. Ở nghiên cứu khác, bapt với kích thước 450 bp được khuếch đại thành công từ 2 chủng vi nấm Colletotrichum gloesporioides, Alternaria alternata. Trong nghiên cứu này, kích thước gen
bapt được ghi nhận từ chủng TQF25 là 500 bp. Chất chiết thô từdịch lên men các chủng vi nấm trên đều được chứng minh chứa hàm lượng paclitaxel đáng kể > 5.2 μg/L. Các kết quả trên góp phần chứng minh rằng PCR khuếch đại các gen liên quan đến sinh tổng hợp paclitaxel là một phương pháp hiệu quả và đáng tin cậy để sàng lọc trước các loại nấm sản xuất paclitaxel.
So sánh với các nghiên cứu trên thế giới, sản phẩm PCR cho gen dbat
và bapt có thích thước dao động. Kích thước gen bapt thu nhận được thường dao động từ 450 - 600 bp, trong khi đó gen dbat có kích thước nằm trong khoảng 153 - 650 bp. Trong nghiên cứu này, gen dbat, bapt từ 4 chủng nấm tiềm năng được khuếch đại thành công với kích thước đạt 550 bp và 500 bp. Sự khác biệt này phụ thuộc vào trình tự mồi thiết kế và kích thước đoạn gen
bapt trên chromosome của chủng vi nấm. Những phát hiện này như một minh chứng quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp paclitaxel được di truyền về mặt di truyền. Sự hiện diện của gen dbat hoặc bapt trong vi nấm nội sinh có thể kết luận rằng chúng có các enzym độc lập chịu trách nhiệm sinh tổng hợp paclitaxel. Sự vắng mặt của gen ts có thể do tiến hoá di truyền vi nấm dẫn đến sự hình thành con đường sinh tổng hợp khác tạo tiền chất taxa-4(5),11(12)- diene.
37