Sau khi đo xong, cửa sổ của phầm mềm chia ra năm phần và file đo vẫn nằm trên phần ngang trên cùng của cửa sổ. Click đúp tên file đo, lúc này file được sao chép và chuyển xuống hai ô phía dưới trong đó một ô là các dòng diễn giải các thông số trong phép đo (ô phía ngoài cùng bên trái), và một ô bên cạnh biểu diễn phổ tổng trở như hình P.4.
Hình P.4: Cửa sổ NOVA sau khi đo
Để xử lí số liệu (trong trường hợp đơn giản nhất thì mạch tương đương đã được mặc định, trong trường hợp cụ thể thì người đo cần nhập mạch tương đương của hệ đo vào trước khi xử lí), click chột phải vào dòng lệnh “FRA measurement potentiostatic” sau đó chọn Add Analysis/ Electrochemical circle fit. Click chuột vào dòng lệnh “Electrochemical circle fit” sau đó dùng chuột chọn 3 điểm trên phổ tổng trở sao cho 3 điểm nằm trên một hình vòng cung.
Một đường thẳng (fitting) được vẽ ra và phần mềm sẽ tính toán giá trị của các thành phần trong mạch tương đương ứng với hệ đo. Các giá trị này có thể xem ở ô bên trái dưới dòng lệnh “Electrochemical circle fit” (xem hình P.5).
3B. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis I. Giới thiệu chung
Hiện nay, máy quang phổ được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện đại. Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) là phương pháp được lựa chọn trong hầu hết các phòng thí nghiệm liên quan đến việc xác định và đo thành phần các hợp chất hữu cơ và vô cơ trong một loạt các sản phẩm và quy trình như nucleic acid và protein, thực phẩm, dược phẩm và phân bón, dầu khoáng và sơn,... Trong các ngành sinh học phân tử, y học và khoa học sự sống, máy đo quang phổ là một thiết bị trợ giúp quan trọng cho cả nghiên cứu và kiểm soát.
Máy đo quang phổ hiện đại có thể thực hiện nhanh chóng, cho kết quả chính xác, đáng tin cậy và chỉ yêu cầu rất ít về thời gian và kĩ năng của người vận hành. Tuy nhiên, để tối ưu hoá các chức năng của thiết bị và có thể áp dụng trong các lĩnh vực quan trọng, cần phải hiểu rõ nguyên lí cơ bản của quá trình hấp thụ cũng như các yếu tố cơ bản của thiết kế máy đo quang phổ. Trong phần này, các vấn đề nền tảng đó được trình bày cho cả sinh viên và các nhà nghiên cứu để có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis trong học tập, giảng dạy cũng như phục vụ các mục đích nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
II. Nguyên lí
II.1. Sự chuyển electron
Electron trong nguyên tử chiếm các mức năng lượng gần nhau. Trong mô hình phân tử phức tạp hơn, các electron đồng thời liên kết với nhiều hạt nhân được gọi là electron liên kết. Chúng dễ dàng chuyển mức năng lượng khi bị kích thích bởi các bức xạ thích hợp. Các electron này thường là các electron p ở lớp vỏ thứ nhất và thứ hai, có thể tồn tại ở một trong hai điều kiện: thuộc liên kết (sigma) trong các liên kết định xứ với xác suất chuyển tiếp thấp (do đó khả năng hấp thụ thấp) hoặc thuộc liên kết π (pi) với xác suất chuyển tiếp cao hơn nhiều. Sự tồn tại của liên kết đôi carbon – carbon trong phân tử làm tăng khả năng liên kết π, do đó tăng khả năng hấp thụ, đặc biệt trong trường hợp có hệ liên kết đôi liên hợp. Hiệu ứng càng lớn hơn khi có sự tham gia của nguyên tố nitrogen.
Liên kết hoá học được hình thành bởi sự xen phủ các obitan nguyên tử, tạo thành các obitan phân tử thuộc một trong ba loại: obitan liên kết
(năng lượng thấp), obitan phản liên kết (năng lượng cao) và obitan không liên kết. Sự hấp thụ năng lượng điển hình nhất có liên quan đến sự chuyển đổi mức năng lượng của các electron thuộc các obitan liên kết và hầu hết các trường hợp đều liên quan đến các nguyên tử có chứa các electron s và p. Hai loại liên kết có thể kể đến là:
– Liên kết với obitan phản liên kết tương ứng *; – Liên kết π với các obitan phản liên kết tương ứng π*.
Các electron không liên kết n không có obitan phản liên kết tương ứng.
Hình P.6: Các quá trình chuyển electron trong phân tử
Các quá trình chuyển electron (bởi sự hấp thụ bức xạ UV-Vis) được phép bao gồm:
– Sự chuyển * và n * đòi sự hỏi hấp thụ bức xạ có năng lượng
cao nên thuộc vùng quang phổ tử ngoại.
– Các bước chuyển n π* và π π* đòi hỏi hấp thụ bức xạ có năng lượng thấp hơn nên thuộc vùng tử ngoại hoặc khả kiến.
Xác suất xảy ra sự chuyển electron (hấp thụ ánh sáng) liên quan chặt chẽ đến cấu trúc obitan phân tử. Nếu cấu hình obitan phân tử đã được biết chính xác thì có thể tính được xác suất chuyển electron và cường độ tương đối của bức xạ hấp thụ (so với những sự chuyển electron khác). Khi có hệ liên hợp trong phân tử, một trong các obitan liên kết có mức năng lượng cao hơn và một obitan khác sẽ có năng lượng thấp hơn so với các liên kết đôi riêng rẽ. Điều này cũng xảy ra tương tự với các obitan phản liên kết. Kết quả là: xác suất chuyển electron tăng, bước sóng hấp thụ cực đại sẽ chuyển về vùng bước sóng dài hơn và cường độ hấp thụ thường tăng lên.
* (phản liên kết) * (phản liên kết) n (không liên kết) (liên kết) (liên kết) N ă ng l ượ ng n * * n * * * *
II.2. Sự hấp thụ bức xạ
Bởi vì mỗi electron trong phân tử có một năng lượng ở trạng thái cơ bản duy nhất và các mức năng lượng mà electron có thể chuyển cũng là duy nhất, do đó, mỗi phân tử sẽ có một tập hợp các khả năng chuyển electron hữu hạn và có thể dự đoán được. Mỗi bước chuyển electron đòi hỏi sự hấp thụ một lượng tử năng lượng và nếu năng lượng đó được lấy từ bức xạ điện từ, sẽ có một mối quan hệ trực tiếp giữa bước sóng của bức xạ điện từ với bước chuyển mà bức xạ đó kích thích. Mối quan hệ đó được gọi là sự hấp thụ riêng và biểu đồ biểu diễn các điểm tương ứng với các bước chuyển dọc theo thang bước sóng được gọi là quang phổ. Trên quang phổ của một chất xác định sẽ xuất hiện các đỉnh hấp thụ cực đại (pic) đặc trưng. Ví dụ, phổ hấp thụ UV-Vis của isoprene xuất hiện pic hấp thụ cực đại tại bước sóng λmax = 222 nm (hình P.7).
Hình P.7: Phổ hấp thụ UV-Vis của isoprene
Phổ hấp thụ UV-Vis của hợp chất là một trong những đặc trưng vật lí hữu ích nhất, cả về phương diện định tính và định lượng. Nếu có sự hấp thụ trong vùng khả kiến và sự hấp thụ cực đại xảy ra trong vùng màu đỏ thì chất đó sẽ có màu xanh lá cây vì màu đỏ và màu xanh lá cây là hai màu bù của nhau.
II.3. Định luật Beer – Lambert
Với mục đích phân tích, có thể áp dụng hai định luật về hấp thụ ánh sáng như sau:
– Định luật Lambert: Tỉ lệ ánh sáng bị hấp thụ bởi môi trường trong suốt không phụ thuộc vào cường độ của ánh sáng tới (với điều kiện không có sự
Độ h ấ p th ụ (nm) Isoprene λmax = 222 nm 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 200 220 240 260 280 300 320 340
thay đổi vật lí hoặc hoá học đối với môi trường). Định luật Lambert được mô tả bởi biểu thức sau:
0 I T
I
trong đó, T là độ truyền qua; I là cường độ của ánh sáng truyền qua; I0 là cường độ ánh sáng tới.
– Định luật Beer: Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ thuận với nồng độ của môi trường hấp thụ và chiều dài quãng đường trong môi trường mà ánh sáng đã đi qua.
A = lC
trong đó, A là độ hấp thụ quang, ε là hệ số hấp thụ mol (dm3 mol–1 cm–1), C là nồng độ mol của dung dịch (mol dm–3) và l là chiều dài ánh sáng đã đi qua (cm).
Hình P.8: Định luật Beer – Lambert
– Kết hợp hai định luật Lambert và Beer thu được định luật Beer – Lambert. Định luật này cho biết mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang (A) và độ truyền qua (T): 0 I 1 A log log C I T l
Điều quan trọng cần lưu ý ε là một hàm của bước sóng và vì vậy, định luật Beer – Lambert chỉ đúng khi áp dụng với ánh sáng đơn sắc.
Định luật này cho thấy độ hấp thụ quang tuyến tính đối với nồng độ chất hấp thụ ánh sáng nhưng điều này chỉ đúng ở nồng độ chất hấp thụ thấp. Đối với độ hấp thụ lớn hơn 3, nồng độ chất sẽ lệch khỏi mối quan hệ tuyến tính A = lC. C l I I0