L ỜI CAM ĐOAN
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống rong biển
Hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy in vitrorong biển trên thế giới tập trung vào những loài có giá trị kinh tế, đặc biệt là ngành rong đỏ, trong đó có các loài chủ yếu thuộc chi Kappaphycusnhư: Rong Sụn, rong Bắp sú và Euchema sp.
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro các loài rong chứa carrageenan
Loài Nguồn mẫu Giai đoạn Môi trường CĐAS
(μmol photons.m-2.s-1) Nhiệt độ (°C) Nguồn tham khảo K. alvarezii Nhánh
Tái sinh trực tiếp và cảm ứng mô sẹo ESS (đặc) 20 – 160 18 – 26 [51]
Cảm ứng mô sẹo ESS + CW (đặc) 25 – 50 23 – 25 [124]
VS 50 40 ± 10 25 ± 1 [52]
Mô sẹo Phôi vô tính và tái sinh cây con PES (lỏng) 5 – 70 22 (± 1) [20]
Tản
Tế bào trần và nảy mầm F/2 và F/4 (lỏng) 20 – 160 20 – 30 [125]
Cảm ứng mô sẹo và tái sinh cây con PES (đặc) 94 22 – 25 [49]
PES (đặc và lỏng) 25 25 [86]
Tái sinh chồi trực tiếp PES (lỏng) 100 (± 10) 25 (± 1) [91, 111]
VS 50 (lỏng) 15 – 50 25 (± 1) [126]
Cây con Thích nghi ngoài tự nhiên AMPEP 25 [127]
Mảnh mô
Cảm ứng mô sẹo và tái sinh
PES (đặc và lỏng) 5 – 90 26 (± 1) [90]
ESS/2 (đặc và
lỏng) 10 – 15 23 – 25 [54]
VS 50 (đặc) 40 (± 10) 23 (± 2) [50]
Tế bào trần và nảy mầm PES (lỏng) 94 – 120 15 – 40 [62]
F/2 60 24 ± 1 [128]
Tái sinh chồi trực tiếp
AMPEP + K+ 27,2 – 33,8 [129, 130]
AN, môi trường
Grund, Ni tơ
thương mại,
AMPEP [84]
Nảy mầm ESS/2 (lỏng) 5 – 45 23 [132]
Eucheuma Mảnh mô Tái sinh chồi trực tiếp PES, VS hoặc F/2 175 20 – 22 [63]
E. serra Tản Tái sinh trực tiếp ASW (lỏng) 7 – 50 12 – 25 [133]
E. denticulatum Mảnh mô Cảm ứng mô sẹo và tái sinh ESS/2 (lỏng) 5 – 80 25 [53]
K. striatus
Bào tử Bào tử MGM (lỏng) 50 25 [134]
Mảnh mô Nảy mầm ESS/2 (lỏng) 10 – 45 20 – 25 [7]
Phương pháp nhân giống như phát sinh chồi trực tiếp, tái sinh cây con thông qua phát sinh phôi từ mô sẹo, sinh sản bằng bào tử và nuôi cấy tế bào trần đã được thực hiện trên nhiều đối tượng rong Kappaphycus. Phương pháp nhân giống bằng bào tử làm tăng sự biến đổi di truyền và rất quan trọng đối với đa dạng sinh học. Tuy nhiên, nhân giống cây con Kappaphycusbằng bào tử mất nhiều thời gian vì thời kỳ cây con kéo dài và vẫn đang ở giai đoạn đầu sự phát triểncông nghệ. Mặt khác, ở cá thể trưởng thành, cả hai cây bào tử và cây tứ bào tử hiếm khi được tìm thấy trong tự nhiên; khác với chi Gracilaria, cây bào tử có thể tìm thấy quanh năm [134]. Phương pháp phát sinh chồi trực tiếp không thông qua phôi bản chất là sinh sản sinh dưỡng, sau vài thế hệ rong bị thoái hóa và giảm sức sống. Nhân giống bằng phương pháp phát sinh phôi
thông qua phát sinh mô sẹo đã được thực hiện trên rong Sụncho kết quả khả quanvới
tỉ lệcảm ứng mô sẹo cao và hệ số nhân nhanh lớn... Trên đối tượng rong Bắp sú gần đây đã có nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp tái sinh chồi trực tiếp [130]. Tuy
nhiên, đến nay vẫn chưa có bất kì nghiên cứu nào được thực hiện trên loài này bằng
phương pháp nuôi cấy mô sẹo. Vì vậy, nghiên cứu nhân giống rong Bắp sú bằng kĩ thuật in vitro thông qua tái sinh phôi vô tính từ mô sẹo là hướng đi mới đầy tiềm năng.
1.4. Tình hình nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và nhân giống rong biển tại Việt Nam tại Việt Nam
Năm 1993, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã di nhập
rong Kappaphyus về trồng và nhân rộng ra khắp các tỉnh miền Trung và Nam Bộ.
Đến nay, cũng có một số nghiên cứu về đặc điểm sinh học và sinh thái. Các kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học và trồng thử nghiệm rong Sụnvào các thủy vực ven biển phía Nam cho thấy điều kiện tự nhiên vùng biển phía Nam hoàn toàn phù hợp cho rong Sụn sinh trưởng và phát triển (TĐTT đạt 2 – 3%/ngày trong mùa khô và 6
– 8%/ngày trong mùa mưa, tương đương với các chỉ tiêu tăng trọng của rong Sụn
trồng ở Philippines, Indonesia...). Các kết quả phân tích sinh hóa cho thấy chất lượng nguyên liệu rong Sụn, rong Sụn gai và rong Bắp sú(hàm lượng K-carrageenan đạt bình quân từ 24 – 29% trọng lượng rong khô, sức đông của K-carrageenan đạt tiêu chuẩn của thế giới (dung dịch 1,5% trong nước, đo ở nhiệt độ 20°C) đạt từ 600 – 1200
g.cm-2) [14, 135].
cho thấy rong Sụncó thể thích nghi với môi trường ưu dưỡng và hấp thu các chất này để phục vụ cho quá trình sinh trưởng [135]. Khi nghiên cứu ba dòng rong Sụn đỏ,
nâu và xanh, kết quả cho thấy dòng rong nâu thuộc rong Sụn có TĐTT 3,5 –
4,6%/ngày vào mùa mưa(tháng 9 năm trước đến tháng 2 năm sau) và 1,6 – 2,8%/ngày
vào mùa khô (từ tháng 3 đến tháng 8). Hàm lượng carrageenan dao động từ 18,8 –
26,4%. TĐTT của dòng màu đỏ (3,6 – 4,4%/ngày) và dòng màu xanh (3,7 –
4,2%/ngày) vào mùa mưa (từ tháng 9 năm trước đến tháng 2 năm sau) [136]. Rong
Bắp sú nuôi ở vịnh Cam Ranh có TĐTT là 4,1 – 5,8%/ngày vào mùa mưa (tháng 9 đến tháng 4) và 2,5 – 3,1%/ngày vào mùa khô (tháng 5 – 8) với hàm lượng
carrageenan 25,1 – 28,7% [30].
Năm 2005, Việt Nam đã di trồng rong Bắp sú có nguồn gốc từ Phillipines. Từ khi di trồng thành công loài rong Bắp sú đến nay, sinh sản sinh dưỡng là phương pháp duy nhất được sử dụng trong nuôi trồng. Những năm đầu mới di nhập, rong có TĐTT cao và có thể trồng quanh nămở những vực nước có độ mặn ổn định. Tuy nhiên, sau gần hai mươi năm nuôi trồng ở Việt Nam, việc sản xuất giống bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng, không có chọn lọc và dưới tác động của điều kiện sinh thái, đã biến đổi về đặc điểm sinh học như TĐTT và hàm lượng cũng như chất lượng K- carrageenan bị suy giảm. Đặc biệt, trong những năm gần đây, ảnh hưởng của biến đổi khí hậu làm rong biển rất dễ bị các dịch bệnh bùng phát, dẫn tới năng suất và chất lượng rong cũng giảm một cách đáng kể [120]. Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào chứng minh sự thoái hóa giống của các dòng rong của loài rong Bắp sú tại Việt Nam. Vì vậy, nghiên cứu này với mục đích đánh giá lại ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sinh thái đối vớiđặc điểm sinh học các dòng thuộc loài rong Bắp sú trong điều kiện sinh thái hiện nay.
Bên cạnh đó, nhân giống rong biển ở Việt Nam chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng và bào tử [137]. Một số nghiên cứu giống in vitro
rong Sụnđã được thực hiện. Kết quả là những nhánh rong Sụn dài 3 – 5 cm sau khi khử trùng sống và phát triển tốt trong môi trường ESS và PES có bổ sung vitamin
hoặc NAA kết hợp với Kin [138–140]. Gần đây, viện Nghiên cứu Hải sản đã nghiên
cứu nhân giống thành công rong Sụnbằng phương pháp nuôi cấy in vitro [141–143]. Nguyễn Thị Duyệt và cộng sự [143] cho rằng tác nhân gây nhiễm chủ yếu trong nuôi
cấy in vitrorong Sụn là vi khuẩn Flavobacteriumsp., nấm Monilinia sp. và rong phụ
sinh Polysiphonia. Sử dụng Betadin (2 phút) sau đó khử trùng mẫu bằng nước Javen
0,25% trong 5 giây, kết quả chỉ 20,83% mẫu sạch và 41,67% mẫu còn sống sau 40 ngày nuôi cấy [143]. Cùng sử dụng chất khử trùng là nước Javen 0,25% trong 5 giây trên đối tượng rong Sụn, nhưng nhóm tác giả Phạm Thị Mát và cộng sự [141] lại có kết quảkhử trùng cao đạt 86,67% mẫu sạch, tỉ lệ mẫu sống đạt 100% và tỉ lệ cảm ứng mô sẹo đạt 96,67% [141]. Mẫu rong Sụn cảm ứng mô sẹo với tỉ lệ là 100% ở môi trường PES chứa 15 g.L-1 agar bổ sung 1 mg.L-1 BA được đặt dưới CĐAS 5 μmol
photons.m-2.s-1. Khối mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường PES có bổ sung 1
mg.L-1BAP kết hợp 2,5 mg.L-1 IAA và 8 g.L-1agar để làm đông môi trường đã cảm ứng phôi vô tính sau 24 –35 ngày nuôi cấy. Những phôi vô tính được chuyển sang môi trường PES lỏng có chứa 1 mg.L-1 BA và 2,5 mg.L-1 IAA, môi trường được lắc liên tục bằng máy lắc trong 10 – 15 ngày thì tạo ra các phôi trưởng thành dày đặc
[141]. Nhóm tác giả đã tái sinh thành công cây con từ vi mầm trong môi trường PES
lỏng và môi trường có bổ sung 1 mg.L-1 phân vô cơ NH4Cl-KH2PO4 hàng ngày. Tóm lại, các phương pháp nuôi cấy in vitronhư tái sinh chồi trực tiếp, tái sinh cây con thông qua mô sẹo, tái sinh cây con bằng tế bào trần hoặc sinh sản bằng bào tử đều được thử nghiệm và cho kết quả khả quan. Tuy nhiên, cho đến nay, nuôi mô rong Sụntừ mô sẹo hoặc tái sinh chồi trực tiếp được thực hiện nhiều hơn và cho kết quả ổn định hơn, với hiệu quả tạo mô sẹo có thể lên tới 100% ở nhiều hình thức phối hợp môi trường nuôi và CĐHSTTV. Theo quá trình khảo sát thực nghiệm, hiện nay ở Việt Nam rong Kappaphycus chỉ sản xuất theo phương pháp truyền thống, giống được giữ vài tháng sau đó được sử dụng cho mùa vụ tiếp theo, sau 2 –3 tháng trồng thương phẩm đã có thể thu thoạch, do đó ngoài tự nhiên chưa ghi nhận được trường hợp nào có bào tử. Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống bằng bào tử rong Kappaphycus
tại Việt Nam sẽ gặp khó khăn do không có nguồn vật liệu ban đầu. Phương pháp nhân giống tái sinh cây con từ phôi vô tính thông qua mô sẹo có đầy đủ những ưu điểm của nuôi cấy in vitro, mặt khác nguồn vật liệu dùng để tái sinh dễ dàng thu được ngoài tự nhiên. Ở Việt Nam, đã có nhiều tác giả nghiên cứu về nhân giống vô tính, tuy nhiên kết quả còn hạn chế, chưa đưa ra được quy trình nhân giống, đến thời điểm hiện tại vẫn chưa được ứng dụng vào trong sản xuất thực tiễn. Hiện nay, giống rong biển chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng. Theo phương pháp này,
chỉ có những nhánh rong có sức sinh trưởng tốt được lựa chọn để nhân giống và đây là nguyên nhân chính dẫn đến suy giảm nguồn gen, kém sức sống kéo theo sự suy giảm về năng suất rong thu hoạch. Nuôi cấy in vitrorong biển là phương pháp khá đơn giản nhưng hiệu quả trong việc lưu giữ những nguồn gen quí phục vụ cho việc sản xuất đại trà theo phương pháp truyền thống. Quá trình phục hồi và nhân nhanh thành rong non có tác dụng “trẻ hóa” nguồn giống, tăng cường khả năng chống chịu với môi trường. Bên cạnh đó, việc kết hợp với các kỹ thuật di truyền như chuyển gen, lai tạo tế bào trong nuôi cấy in vitrorong biển càng làm tăng nhanh chất lượng rong giống theo ý muốn. Vì vậy, nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái rong Bắp sú để đánh giá so sánh sự phát triển của các dòng rong, từ đó chọn ra dòng có đặc tính tốt nhất để nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro là việc làm cần thiết. Kết quả tạo ra được thế hệ cây con có đặc tính tốt, có khả năng chịu được nhiệt độ cao, kháng bệnh, từ đó nâng cao năng suất nuôi trồng cũng như chất lượng rong.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu