L ỜI CAM ĐOAN
2.3.3.3. Tạo nguồn vật liệu
Thử nghiệm các loại môi trường dinh dưỡng đối với sựsinh trưởng của rong giống trong điều kiện in vitro giai đoạn thuần hóa
Một dòng rong thuộc loài rong Bắp sú có đặc điểm sinh học tốt nhất được nuôi trồng ở vùng sinh thái phù hợp dựa theo kết quả của thí nghiệm trên được chọn để làm thí nghiệm. Rong khỏe màu nâu tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp, đã được giữ 2 tuần trong điều kiện bán tự nhiên theo mô tả ở trên. Sau đó, dùng dao mổ cắt thành những mẫu có kích thước khoảng 5 cm, khối lượng khoảng 1,2 g. Các mẫu rong này được nuôi dưới điều kiện in vitro trong bình thủy tinh 500 mL có chứa 400 mL các loại môi trường dinh dưỡng như: PES; PES ½; ½ PES (Phụ lục 1.4.2) [77]; MPI; MPI
½; ½ MPI (Phụ lục 1.4.3) [78]; MS; MS ½ và ½ MS (Phụ lục 1.4.1) [79] và đối chứng
(không bổ sung dinh dưỡng)nhằm xác định loại môi trường thích hợp trong giai đoạn nuôi thuần hóa rong giống. Môi trường nuôi trồng là các môi trường dinh dưỡng được pha bằng nước biển có độ mặn 30 –35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Các bình thủy tinh có lắp sục khí.Thay nước sau mỗi 1 tuần đồng thời bổ sung dinh dưỡng. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức là 3 bình thủy tinh chứa 10 nhánh rong/bình.
Khử trùng mẫu in vitro
Thu nhận và tiền xử lý mẫu:Những nhánh rong khỏe có màu sắc tươi sáng, có nhiều nhánh thứ cấp đã được thuần hóa trong phòng thí nghiệm 4 tuần, sử dụng dao mổ cắt thành những đoạn dài khoảng 5 cm. Sau đó, những đoạn rong này được khử
trùng thô trên bề mặt theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Các mẫu cấy được chuyển vào bình tam giác (có thể tích 250 mL) đậy kín bằng nút cao su và đưa vào tủ cấy vô trùng.
Thao tác khử trùng mẫu cấy:Rong đã được khử trùng thô bằng dung dịch nước tẩy rửa theo mô tả như trên. Trong tủ cấy, mẫu được rửa với nướcbiển vô trùng 4 – 5 lần, mỗi lần 5 phút. Tiếp đó, mẫu được khử trùng bằng nano bạc (Phụ lục 1.2) có bổ sung vài giọt Tween-80 hoặc kháng sinh (Phụ lục 1.2) với nồng độ, thời gian khác nhau tùy từng chất khử trùng và đối chứng (Natri hypochlorite) (Bảng 2.1). Cuối cùng, mẫu được rửa lại 4 –5 lần bằng nước biển vô trùng trước khi cấy mẫu vào môi trường. Mục đích của thí nghiệm này là đánh giá hiệu quả của loại chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu đối với tỉ lệnhiễm VSV, tỉ lệ mẫu sống và sạch VSV.
Bảng 2.1.Nồng độ, thời gian khử trùng bằng nano bạc và kháng sinh
Chất khử trùng Thời gian Nồng độ (%) Nano bạc 5 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 10 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 20 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 30 phút 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,10 Kháng sinh 24 giờ 1; 2; 3; 4 Natri hypochlorite 15 phút 1
Sau khi khử trùng, tiến hành cắt nhỏ mẫu vô trùng với kích thước 4 – 5 mm rồi đặt vào bình có chứa 20 mL môi trường PES (bổ sung 15 g.L-1agar để làm đông môi trường) theo phương pháp của Reddy và cộng sự [48]. Những lọ chứa mẫu được đặt dưới điều kiện in vitro. Môi trường nuôi cấy là môi trường PES được pha bằng nước biển có độ mặn 30 – 35‰ đã được lọc qua lưới có kích thước lỗ 22 µm và bổ
sung 15 g.L-1 agar (Algae culture agar, Himedia, Ấn Độ). Môi trường đượchấp khử
trùng bằng autoclave ở 121oC với thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí với mỗi nghiệm thức được cấy 30 bình, mỗi bình 1 mẫu.