A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
3.2.1.1. Thiết kế đoạn gen CPi từ vùng bảo thủ của gen CP của SM
Theo cơ chế RNAi, sự ức chế RNA ngoại lai chỉ xảy ra khi có sự tương đồng cao giữa các siRNA và RNA đích. Mặt khác, hiệu quả kháng virus của cây chuyển gen phụ thuộc rất nhiều vào vai trò và chức năng gen của virus cần
phân hủy. Chính vì vậy lựa chọn vùng gen nào để thiết kế cấu trúc RNAi được cho là khâu quan trọng đưa đến sự thành công kỹ thuật RNAi. Căn cứ vào trình tự gen CP phân lập được từ hai dòng virus SMV tại Sơn La (SL1, SL2) và các thông tin về trình tự gen CP của SMV đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế,
vùng bảo thủ của gen CP ở SMV và BYMV đã được xác định khi sử dụng BLAST trong NCBI. Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein vỏ (CP) được chia thành ba miền: đầu N, vùng lõi và đầu C. Phân tích trình tự CP của SMV cho thấy có sự khác biệt lớn về kích thước và trình tự
amino acid, nhưng lại có sự tương đồng cao về trình tự ở vùng đầu C của CP. Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn vùng 3’ của gen CP ở SMV để thiết kế đoạn gen CPi của SMV (CPi-SMV), đồng thời lựa chọn vùng 3’ của gen CP để thiết kế đoạn gen CPi của cả hai loài virus SMV và BYMV (CPi [SMV-
BYMV]), sau đó đoạn gen được tổng hợp tại hãng Intergrated DNA Technology (Mỹ) làm nguyên liệu để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi. Đoạn gen CPi của SMV (ký hiệu là CPi-SMV) sử dụng để thiết kế vector
chuyển gen có 294 nucleotide (Hình 3.8). Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/SMV- CPi-Ri được thiết kế để nhân bản đoạn CPi-SMV có trình tự được trình bày ở bảng 3.6.
Hình 3.8. Trình tự đoạn CPi-SMV thiết kế từ vùng bảo thủ của đoạn gen CP ở
Bảng 3.6. Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide
SMV-CPi-Fi 5’- CACCGCAGCAGAAGCTTACA - 3’
SMV-CPi-Ri 5’ - GCCCAAAAGAGTGTGCATGT - 3’