A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
2.2.1.4. Kỹ thuật tách dòng gen và xác định trình tự nucleotide
Tách dòng phân tử được thực hiện theo Sambrook và đtg 2001 [139].
i) Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR sau điện di được cắt lấy băng quan tâm và làm sạch (thôi gel) theo hướng dẫn của AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer) gồm các bước sau: (1) Cân gel theo quy ước 1 mg tương đương với 1µl. (2) Bổ sung
dịch GB theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = 1 : 5 (µl). (3) Ủ ở 60oC trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn. (4) Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (5) Bổ sung 500 µl GB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (6) Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (7) Thêm 500 µl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết dung dịch WB. (8) Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml và (9) Hòa tan DNA trong 30 - 50 µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút, lấy dịch.
ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT
Sản phẩm thôi gel được gắn vào vector tách dòng pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Sản phẩm PCR đã tinh sạch 5 2 Đệm T4 ligase (10X) 2 3 T4 ligase (1U/µl) 1 4 Vector pBT (30 ng/µl) 1 5 H2O 1 Tổng 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22 oC trong 90 phút. Sau đó đặt phản ứng lên đá và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α.
iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α
(1) Tiến hành bổ sung 5 µl sản phẩm ghép nối vào ống đựng tế bào khả biến đã làm tan đá, trộn nhẹ bằng tay sau đó ủ trong đá 30 phút. (2) Sốc nhiệt tế bào ở 42oC trong 45 giây và chuyển ngay vào đá, để 5 phút. (3) Bổ sung 250µl môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở 200v/p, 37oC trong 1 giờ. (4) Cấy
trải 200 µl dịch biến nạp lên đĩa LB bổ sung ampicilin 100mg/l, X-gal 30 mg/l và 200 mM IPTG, sau đó nuôi trong khoảng 14 - 16 giờ ở 37oC.
iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc xanh, trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen CP nằm trên vector pBT để xác định khuẩn lạc có mang đoạn gen đích. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.
v) Tách chiết plasmid
Sử dụng Plasmid Extraction Kit và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmid đối với những khuẩn lạc có sản phẩm colony-PCR dương tính. Đây là phương pháp tách plasmid với số lượng lớn từ 2 - 5 ml dịch khuẩn gồm các bước sau: (1) Hút 2 ml dịch khuẩn và ly tâm 8000 v/p trong 5 phút để thu cặn tế bào. (2) Bổ sung 250 µl dung dịch RS, vortex để phá vỡ tế bào. (3) Bổ sung 250 µl BL buffer và trộn nhẹ bằng tay sau đó bổ sung 350 µl NE buffer và đảo ống ngay lập tức để tránh kết tủa cục bộ. (4) Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút ở 4oC, hút dịch chuyển lên cột. (5) Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (6) Bổ sung 500 µl DE vào cột, đợi 5 phút, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (7) Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết WB. (8) Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. (9) Hòa tan DNA plasmid trong 30 - 50 µl nước khử ion, khử trùng để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13.000v/p trong 1 phút, lấy dịch. (10) Điện di kiểm tra plasmid trên gel agarose 0,8%.
vi) Xác định và phân tích trình tự nucleotide
Các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CP của SMV được xác định trình tự trên máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Các trình tự được xử lý bằng các phần mềm
BLAST/NCBI, DNAstar và BioEdit. So sánh trình tự gen đoạn CP của SMV phân lập trong thí nghiệm với các chủng SMV và BYMV của Việt Nam và các chủng đại diện cho các vùng trên thế giới đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.