A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm
2.2.2.2. Dòng hóa đoạn gen CPi vào vector tách dòng pENTRTM/D-TOPO® i) Thực hiện phản ứng ghép nố
i) Thực hiện phản ứng ghép nối
Sản phẩm PCR tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pENTRTM/D- TOPO để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mong muốn (ký hiệu: pEN- CPi).
Hỗn hợp phản ứng được ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 - 23oC). Sau khi thực hiện phản ứng, đặt ống dung dịch phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. coli One Shot® Top 10.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pENTRTM/D-TOPO
Thành phần Thể tích (µl)
Sản phẩm PCR đã tinh sạch (~200 ng) Dung dịch đệm
Nước cất khử ion khử trùng
pENTRTM/D-TOPO vector (20 ng/µl)
2,0 1,0 2,0 1,0
ii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp pEN-CPi vào tế bào khả biến E. coli TOP 10
Tiến hành bổ sung 2 µl vector đã gắn gen vào tế bào khả biến và trộn nhẹ, ủ trong đá 5 – 30 phút. Sau đó sốc nhiệt tế bào trong 30 giây, 42oC và chuyển ngay ống khuẩn vào khay đá. Bổ sung 250 µl môi trường S.O.C ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC trong 1giờ. Tiếp theo cấy trải 50 - 200 µl dịch biến nạp lên đĩa chọn lọc chứa kanamycin 50 mg/l được làm ấm lại và ủ qua đêm ở 37oC.
iii) PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) để chọn dòng tế bào
Sau khi thu vi khuẩn mang vector tái tổ hợp đã biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc, thu được những khuẩn lạc màu trắng, trong đó, 10 khuẩn lạc tròn màu trắng được chọn ngẫu nhiên để xác định khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi M13-F và M13-R nằm trên vector pENTRTM/D-TOPO® và cặp mồi đặc hiệu (SMV-CPi- F/SMV-CPi-R, SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R) với thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR nhân gen (Mục 2.3.2.2). Sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.