Ở thực vật có ba con đường ức chế gen bởi RNAi. Con đường thứ nhất
là sự ức chế gen sau phiên mã (post-transcriptional gen silencing-PTGS) qua
trung gian là siRNA (short interfering RNA). Con đường thứ hai là hiện
tượng tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều chỉnh biểu hiện gen của tế
bào (Hình 1.4).
Con đường thứ ba là sự câm gen phiên mã (transcriptional gene
silencing - TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực
tiếp qua siRNA, nó bao gồm sự methyl hóa histone và DNA.
Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là những RNA
ức chế nhỏ siRNA hay miRNA, các enzyme Dicer, Doshar và Argonaute
Hình 1.4. Mô phỏng các con đường làm câm gen thông qua RNAi [119]
AGO: Argonaute); dsRNA: double-stranded RNA; PTGS: posttranscriptional gene silencing; RDR: RNA dependent RNA polymerase; RISC: RNA-induced silencing complex; RITS: RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing; siRNA: short interfering RNA; miRNA: miro-RNA; TGS: transcriptional gene silencing
Sự ức chế gen sau phiên mã thông qua siRNA
siRNA được tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer, đây là phần tử mấu chốt của cơ chế làm câm gen của RNAi. Cấu trúc nguyên vẹn của phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu của quá trình RNAi. Hai mạch của sợi kép siRNA khác nhau về độ bền với nhiệt độ cuối cùng, một thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết trong siRNA sẽ đi vào phức hệ RISC. Sự giãn xoắn của siRNA tạo ra sợi dẫn đầu (guide strand) sẽ đi vào phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bởi sự bổ sung trình tự tương đồng. Sợi còn lại được gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và sẽ bị phân hủy sau đó. Do đó sợi dẫn đầu siRNA phải tương tác với một số protein liên quan trong quá trình RNAi từ khi được tạo ra cho đến lúc nhận biết mRNA đích.
Đoạn siRNA được tạo thành dài khoảng 21 – 25 nucleotide mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH với 2 nucleotide ở đầu 3’ [63]. Sợi sense của mạch kép siRNA dễ bị thay đổi hóa tính hơn là sợi antisense, sự thay đổi diễn ra ở giữa và ở phía đầu 3’ của siRNA có ảnh hưởng chặt chẽ tới tính đặc hiệu của RNAi hơn là những thay đổi ở đầu 5’ [22].
Nhiều nghiên cứu cho thấy là sợi đối mã có hoạt động quan trọng trong phức hợp sense và RNA đích. Các nucleotide ở đầu 3’ cũng có ý nghĩa trong quá trình xử lý RNAi. Khi tăng hoặc giảm số nucleotide đầu 3’ sẽ làm giảm hiệu quả khởi động quá trình. Khi tiến hành thử thay thế nhóm 5’-PO4 bằng một nhóm chất lớn hơn như 2’-O- methyl thì kết quả ảnh hưởng nghiêm trọng đến sợi kép siRNA khởi đầu cho chuỗi phản ứng RNAi trong cơ thể. Phát hiện này và một số quan sát khác đã làm rõ chức năng quan trọng của nhóm 5’-PO4. Sự có mặt của 5’-PO4 làm ổn định phức hệ RISC và rất quan trọng cho sự xác định bắt cặp chính xác của RISC và phân cắt đúng vị trí trên RNA đích. Nếu vắng mặt nhóm 5’-PO4, siRNA sẽ trượt dài theo phức hệ RISC. Nhóm 5’-PO4 có thể được tách ra khi quá trình phân cắt đang thực hiện trên RNA đích. Một đoạn siRNA sợi kép nếu thiếu cả hai hoặc một nhóm 5’-PO4 sẽ không thể khởi đầu chuỗi RNAi trong tế bào [135]. Sự có mặt của nhóm 3’-OH cũng quan trọng nhưng không thật sự cần thiết bởi sự thay đổi diễn ra ở đầu này không gây ảnh hưởng nhiều đến quá trình RNAi.
Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tương bào và là con đường quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus. Trong trường hợp là virus DNA thực vật, dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối nhau [36], [76]. Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tương bào, Dicer - một loại ribonuclease đặc hiệu cho dsRNA lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotid, gọi là siRNA có tiêu hao một phân tử ATP [36]. siRNA tạo ra là những sợi đôi có chứa nhóm phosphat ở tận cùng đầu 5’. Sau khi bị cắt ngắn bởi dicer, chuỗi kép
siRNA được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA xảy ra trong phức hệ RISC, trong đó có chứa Argounaute và Helicase [141]. Phân tử ATP phân tách siRNA sợi đôi để tạo thuận lợi cho RISC hoạt động, phức hệ RISC sau đó nhận biết các phân tử phiên mã mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC [147]. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base bổ sung với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNase.
Sự ức chế RNA thông qua miRNA
Ngay sau khi phát hiện ra cơ chế RNAi, người ta nhanh chóng nhận ra rằng, cơ chế này đã tồn tại trong tế bào bởi một hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (miRNA).
Sự khác biệt quan trọng giữa miRNA và siRNA trước hết là nguồn gốc của chúng, miRNA bắt nguồn từ các locus hệ gen trong khi siRNA thường bắt nguồn từ mRNA, transposon hoặc virus. Thứ hai, miRNA được chế biến từ phiên mã có thể tạo cấu trúc kẹp tóc RNA trong khi siRNA được chế biến từ RNA sợi đôi dài hoặc dạng kẹp tóc kéo dài. Thứ ba, sợi đôi miRNA/miRNA* được tạo ra từ tiền phân tử kẹp tóc miRNA, dẫn tới tích luỹ nhiều miRNA khác nhau từ các sợi dsRNA dài này. Thứ tư, trình tự miRNA tương đối bảo thủ ở những sinh vật có quan hệ gần gũi, trong khi siRNA nội sinh hiếm khi bảo thủ [34]. Những sự khác nhau này là cơ sở thực tế để phân biệt và chú giải những siRNA nội sinh và miRNA mới khám phá [29].
miRNA là một loại RNA nhỏ dài 21-24 nucleotide không mã hóa có chức năng chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp bazơ có trình tự bổ sung gần như hoàn toàn với mRNA đích [34]. Cơ chế miRNA có nhiều điểm
tương đồng với cơ chế siRNA. Trong tế bào sinh vật, khi những phân tử miRNA đầu tiên (gọi là pre-miRNAs) được tạo ra trong nhân qua quá trình phiên mã từ gen, pre-miRNAs được cắt gọt bởi một enzyme có trong nhân gọi là drosha để tạo thành những sợi pre-miRNAs. Các pre-miRNAs sau đó được di chuyển ra ngoài bào tương và tương tác với enzyme dicer tạo thành miRNA rồi kế tiếp là phức hệ RISC như trình bày ở trên. Ở thực vật, miRNA được tạo thành nhờ dicer và phần lớn chỉ xảy ra ở nhân, và có một protein liên kết dsRNA đặc hiệu là HYL1. miRNA động vật thường liên kết với vùng 3’ không dịch mã (untranslated region, UTR) của mRNA, trong khi miRNA thực vật có gắn kết với trình tự mã hóa và thậm chí vùng 5’ UTR của mRNA [150]. Một điều đáng chú ý là, ở thực vật miRNA ức chế biểu hiện mRNA chủ yếu qua sự tiêu hủy mRNA, trong khi đó ở động vật miRNA can thiệp chủ yếu bằng cách ức chế quá trình dịch mã của mRNA [34]. Độ tương đồng trong trình tự của miRNA với mRNA trong phức hệ RISC sẽ quyết định mRNA sẽ bị cắt và tiêu hủy làm bất hoạt quá trình dịch mã của mRNA. Nếu trình tự của miRNA giống hệt với trình tự của mRNA, mRNA sẽ bị tiêu hủy. Nếu trình tự của miRNA tính từ đầu 5' chỉ cần tối thiểu tương đồng với mRNA từ nucleotid vị trí số 2 đến số 8 thì cơ chế miRNA sẽ kích hoạt, tức là chỉ chặn đứng sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA [59].
Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp ở vùng mã hoá [33], [34], [62]. Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan[33], [134], [136]. Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã rộng[27]. Biểu hiện của chúng đã chứng tỏ chúng có vai trò quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới hạn áp lực môi trường [134], [150]. Các kiểu biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA
có thể điều khiển nhiều quá trình lý sinh và phát triển, có thể giữ vai trò trực tiếp trong sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật [62].
Hình 1.5. Con đường ức chế gen của siRNA và miRNA [59]
Methyl hoá DNA
Con đường làm câm gen thứ ba ở thực vật có liên quan tới sự methyl hoá DNA và sự ức chế phiên mã. Bằng chứng đầu tiên cho dạng câm gen này là khám phá trên thực vật mà gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hoá DNA tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu. Gần đây, những phát hiện này đã được mở rộng bằng việc quan sát sự methyl hoá DNA thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi histone [181].