cây dâu tây
Sau 6 tuần nuôi cấy, kết quả ghi nhận cho thấy khả năng khử trùng mẫu lá của AgNPs ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau có sự khác biệt so với HgCl2 (Bảng 3.2). Quá trình tái sinh chồi từ lá cây dâu tây là một quá trình chuyển tiếp gồm 3 giai đoạn bao gồm cảm ứng mô sẹo, tái sinh chồi và sự tăng trưởng của chồi (Hình 3.2).
Mẫu lá được khử trùng bằng 0,05 – 0,5 g/L AgNPs trong 5 phút nhiễm nấm 100% trong tuần đầu tiên; 0,05 g/L AgNPs trong 10 – 30 phút đều bị nhiễm nấm và khuẩn sau 6 tuần nuôi cấy; 0,1 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 30 phút cho thấy các mẫu lá bị hoại tử và hoá nâu, sau đó nấm và khuẩn phát triển sau 6 tuần nuôi cấy (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, AgNPs ở nồng độ thấp (0,05 g/L) hoặc thời gian ngắn (5 phút), dài (30 phút) đều không có hiệu quả trong quá trình khử trùng. Mặt khác, mẫu lá được khử trùng 0,1 g/L – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 10 – 20 phút cho tỷ lệ nhiễm thấp (Bảng 3.2). Đặc biệt, ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 20 phút (22,22% – 28,89%) cho tỷ lệ nhiễm thấp so với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (49,99%) (Bảng 3.2).
Bên cạnh đó, sự sinh trưởng của mẫu cấy cho thấy các mẫu lá ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cảm ứng mô sẹo sớm nhất trong tuần đầu tiên và phát sinh chồi ở tuần thứ 2; sớm hơn so với các nghiệm thức bổ sung AgNPs khác (các mô sẹo xuất hiện rải rác ở tuần thứ 2, phát sinh chồi ở tuần thứ 3) và HgCl2 các mô sẹo xuất hiện ở tuần thứ 3, phát sinh chồi ở tuần thứ 4. Sau 3 tuần nuôi cấy, các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs đã trải qua giai đoạn hình thành mô sẹo và đang trong quá trình hình thành chồi (Hình 3.2a); so với chỉ hình thành mô sẹo ở 5 g/L HgCl2 trong 5 phút (Hình 3.2c).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây sau 6 tuần nuôi cấy
Chất khử trùng Nồng độ (g/L) Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm và hoại tử (%) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi/ mẫu Chồi cao > 1,5 cm Hình thái mẫu AgNPs 0,05 5 100,00a* - - - Nhiễm nấm 10 100,00a - - - Nhiễm nấm, khuẩn 15 100,00a - - - 20 100,00a - - - 30 100,00a - - - 0,1 5 100,00a - - - Nhiễm nấm 10 73,33b 22,22d 10,00c 0,00c Chồi nhỏ 15 63,33bc 30,00cd 12,33bc 0,00c 20 60,00bc 33,33bcd 11,33bc 0,00c 30 100,00a - - - Nhiễm nấm, khuẩn 0,2 5 100,00a - - - Nhiễm nấm 10 60,00bc 34,44bcd 10,66c 0,00c Chồi nhỏ 15 37,78de 56,66abc 15,66abc 4,00b Chồi lớn 20 28,89ef 64,44a 21,00a 6,66a 30 100,00a - - - Nhiễm nấm, khuẩn 0,5 5 100,00a - - - Nhiễm nấm 10 48,88cd 45,55abcd 13,00bc 0,00c Chồi nhỏ 15 36,66de 61,11ab 13,33abc 4,00b Chồi lớn 20 22,22f 57,78abc 19,00ab 4,66b 30 100,00a - - - Nhiễm nấm, khuẩn
HgCl2 1 5 49,99cd 46,66abcd 16,33abc 0,00c Chồi nhỏ
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Tỷ lệ tái sinh chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 10 – 20 phút (45,55 – 64,44%) tương tự với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (46,66%) sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút (15,66 – 21,00) tương tự với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (13,66). Tuy nhiên, ở 1 g/L HgCl2 trong 5 phút không ghi nhận được số lượng chồi cao hơn 1,5 cm. Số lượng chồi cao hơn 1,5 cm ghi nhận cao nhất (6,66) các ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút. Các chồi hình thành ở 1 g/L HgCl2 trong 5 phút có sự phân nhánh khá cao, từ một chồi hình thành thêm 2 – 3 chồi mới có kích thước nhỏ hơn 1,5 cm và có hình thái bất thường (Hình 3.2d) và bị hiện tượng thuỷ tinh thể. Những chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút có sự hình thành chồi đơn rõ ràng, các chồi to, khoẻ, tách nhau ra riêng biệt (Hình 3.2b). Đây là nguồn vật liệu tốt cho quá trình vi nhân giống.
Hình 3.2. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá cây dâu tây được khử trùng bằng AgNPs so với HgCl2 sau 3 và 6 tuần nuôi cấy
a, b: mô sẹo và chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 3 và 6 tuần nuôi cấy; c, d: mô sẹo và chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng HgCl2 sau 3 và 6 tuần nuôi cấy.
Như vậy, các mẫu lá cây dâu tây được xử lý bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút cho tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ tái sinh chồi cũng như số chồi cao hơn so với 5 g/L HgCl2 trong 5 phút. Đặc biệt ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho chất lượng chồi tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại.
3.1.3.Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh
Tất cả các mẫu lá được khử trùng bằng 0,05 g/L trong 5 – 20 phút, 0,1 g/L AgNPs trong 5 – 10 phút và 0,2 g/L AgNPs trong 5 phút đều ghi nhận nhiễm nấm 100%; 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 30 phút cho thấy các mẫu hoá nâu, hoại tử và sinh khuẩn sau 6 tuần nuôi cấy (Bảng 3.3). Ở các nồng độ AgNPs còn lại và 1 g/L HgCl2 trong 5 phút có số lượng nhiễm dao động từ 20 – 70% phụ thuộc vào nồng độ và thời gian khử trùng. Trong đó, tỷ lệ nhiễm của mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút (20,00 – 36,67%) thấp hơn đáng kể so với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (48,88%). Tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 10 – 20 phút (45,55 – 72,22%) tương đồng với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút) (46,66 – 56,66%) (Bảng 3.3).
Ngoài ra, các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs cho thấy các mô sẹo cảm ứng xung quanh mép cắt của lá sau 1 tuần nuôi cấy (Hình 3.3a); sau đó cảm ứng trên toàn bộ bề mặt lá (Hình 3.3b); 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cho sự cảm ứng mô sẹo muộn hơn (tuần thứ 3). Các mẫu lá được khử trùng AgNPs cho các mô sẹo xốp dần, sinh phôi và đôi khi có hình thành cụm mô với kết cấu tơi xốp trắng sau 4 tuần nuôi cấy (Hình 3.3c). Các mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho khối lượng tươi mô sẹo đạt cao nhất là 0,77 g; và các mô sẹo ở nghiệm thức này màu trắng ngà và có khả năng phát sinh phôi sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3d,e). Các mẫu lá khử trùng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cho các mô sẹo hoá nâu và hoại tử (Hình 3.3f). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của AgNPs là khá rõ ràng trong thí nghiệm này; các chất khử trùng thông dụng như HgCl2 có sự cảm ứng mô sẹo chậm hơn so với AgNPs cũng như khả năng biệt hoá tạo mô sẹo không cao và không rõ ràng như AgNPs mặc dù tất cả các nghiệm thức trong thí nghiệm đều hình thành mô sẹo và có cấu trúc cơ bản giống nhau.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy
Chất khử trùng Nồng độ (g/L) Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm và hoại tử(%) Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Khối lượng tươi (g) Hình thái mẫu AgNPs 0,05 5 100,00a* - - Mẫu nhiễm nấm 10 100,00a - - 15 100,00a - - 20 100,00a - -
30 68,88b 24,44d 0,44fg Mô sẹo màu trắng ngà 0,1 5 100,00a - - Mẫu nhiễm nấm 10 100,00a - - 15 63,33bc 30,00cd 0,54de
Mô sẹo màu trắng ngà 20 60,00bc 33,33cd 0,66bc 30 70,00b 23,33d 0,51ef 0,2 5 100,00a - - Mẫu nhiễm nấm 10 58,89bc 34,44cd 0,57cde
Mô sẹo màu trắng ngà 15 36,67de 56,66abc 0,53de
20 26,66e 72,22a 0,77a
30 100,00a - - Mẫu nhiễm khuẩn
0,5
5 52,22bcd 41,11bcd 0,67b
Mô sẹo màu trắng ngà 10 47,77cd 45,55abcd 0,57cde
15 20,00e 66,67ab 0,58bcde 20 35,55de 57,77abc 0,61bcd
30 100,00a - - Mẫu nhiễm khuẩn
HgCl2 1 5 48,88cd 46,66 abcd 0,41g Mô sẹo hoá nâu
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Hình 3.3. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá sâm Ngọc Linh được khử trùng bằng AgNPs so HgCl2 sau 1, 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy
a, b, c, d: mô sẹo ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 1, 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy; e: Các mô phôi hình cầu (quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại: 1.000.000) ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 6 tuần nuôi cấy; f: mô sẹo ở nghiệm thức khử trùng bằng HgCl2 sau 6 tuần nuôi cấy.
Như vậy, có thể thấy mẫu được xử lý 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút cho hiệu quả khử trùng cũng như tỷ lệ tái sinh cao. Tuy nhiên, chỉ có các mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho hiệu quả khử trùng cũng như khối lượng mô sẹo và hình thái mô sẹo tốt nhất.
Khử trùng là một trong những giai đoạn quan trọng quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro. Công dụng của AgNPs trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để ngăn chặn nhiễm khuẩn đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau [58], [88], [114], [132], [148]. Trong nghiên cứu này, ba đối tượng cây trồng (salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh) đều cho thấy hiệu quả khử trùng cũng như quá trình cảm ứng mẫu cấy của AgNPs tối ưu hơn so với các chất khử trùng thông dụng là HgCl2. Điều này cho thấy tác dụng diệt khuẩn của AgNPs theo nhiều cơ chế khác nhau [44] cộng với cấu trúc hạt đạt kích thước tới hạn (20 – 25 nm) cho phép một lượng lớn các nguyên tử có thể tương tác tiếp xúc bề mặt, dễ dàng xâm nhập, tác động sâu bên trong các vi sinh vật làm tăng đáng kể hiệu quả khử trùng, hay tác động vào tế bào thực vật tạo ra sự khác biệt trong tốc độ cảm ứng và phát triển của mẫu cấy so với những vật
liệu thô [114], [141]. Kết quả nghiên cứu này cho thấy AgNPs có thể thay thế các chất khử trùng thông dụng là HgCl2 trong giai đoạn khử trùng bề mặt mẫu cấy.
Kết quả nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2018) khi báo cáo về ảnh hưởng của AgNPs trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy cây african violet (Saintpaulia ionantha) ở nồng độ 0,5 g/L trong 15 phút [12]. Các nghiên cứu trước đó cũng cho rằng AgNPs và các hợp chất của nó có tác dụng hiệu quả trong việc kiểm soát nhiễm nấm và khuẩn [22], [27], [58], [132].
Năm 2008, lần đầu tiên Abdi và cộng sự tiến hành nghiên cứu khử trùng bề mặt mắt ngủ cây nữ lang (Valeriana officinali). Theo đó, các tác giả đã kết luận sử dụng AgNPs nồng độ 0,1 g/L trong 180 phút sẽ cho kết quả khử trùng tốt nhất (89%) và không ảnh hưởng đến sự nhân chồi và ra rễ sau đó [22]. Tương tự, trong khử trùng đài hoa chưa trưởng thành của cây đồng tiền (Gerbera jamesonii) ở 15 g/L NaOCl trong 10 phút kết hợp với 0,2 g/L AgNPs trong 15 phút đã khử nhiễm thành công tất cả các tác nhân gây nhiễm, không có tác dụng phụ đối với sự phát sinh cơ quan [58]. Các kết quả này tương đồng với kết quả của chúng tôi về khả năng khử trùng của AgNPs cũng như nồng độ khử trùng, tuy nhiên có sự khác biệt về nguồn mẫu, kích thước hạt nano, thời gian khử trùng và phương pháp thiết kế thí nghiệm. Kết quả cho thấy tỷ lệ khử trùng thành công ở những thí nghiệm này tương đương hoặc cao hơn không đáng kể so với nghiệm thức tốt nhất trong nghiên cứu của chúng tôi. Nguồn mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là các lá non do đó nếu thời gian khử mẫu quá dài sẽ gây ra hiện tượng dập lá và có thể ảnh hưởng đến hiệu quả khử trùng. Chúng tôi không sử dụng kết hợp AgNPs với NaOCl như các nghiên cứu trước đây, ngoài trừ cồn được sử dụng trong khử trùng sơ bộ. Mặt khác, Arab và cộng sự (2014) cho rằng thời gian không có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả khử trùng trên gốc ghép của hạnh nhân (Prunus amygdalus) và đào (Prunus pesica) [27]. Điều này có thể do nhóm tác giả đã ngâm mẫu cấy trong các khoảng thời gian quá ngắn (3, 5, 7 phút). Trong thí nghiệm của chúng tôi cả nồng độ và thời gian đều có tác động đáng kể đến tỷ lệ thành công của quá trình này; thời gian chúng tôi sử dụng là 5, 10, 15, 20, 30 phút đã có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả khử trùng trên cả ba đối tượng nghiên cứu (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh).
Bên cạnh hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu cấy, AgNPs cũng cho hiệu quả cảm ứng mô sẹo trên mẫu lá cây salem và sâm Ngọc Linh hay tái sinh chồi thông qua mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu lá dâu tây. Kết quả ghi nhận cho thấy AgNPs ảnh hưởng đến giai đoạn đầu của quá trình tái sinh; các mẫu cấy được kích thích sớm hơn so với HgCl2 trong cảm ứng tạo mô sẹo. Điều này có thể là do khi mẫu cấy tiếp xúc với HgCl2 dẫn đến nguyên tử hydro trong cấu trúc phân tử được thay thế bởi Cl2, phá huỷ hệ enzyme của vi khuẩn, gây chết vi sinh vật. Bên cạnh đó, chúng cũng gây tổn thương các mô tế bào thực vật; vì thế chúng ta không khó để gặp phải tình trạng mẫu cấy chết hay sống nhưng không thể tái sinh hoặc thời gian tái sinh kéo dài. Ngược lại, thông qua quá trình khử trùng các AgNPs được hấp thu một cách bị động qua lá, bằng cách đi vào khí khổng trên lá, từ đó di chuyển vào hệ thống mạch của lá và vận chuyển đến các cơ quan qua phloem gây mã hoá gene auxin trong tế bào thực vật, kích thích khiến lượng auxin nội sinh tăng gây cảm ứng mẫu cấy [152]. Kết quả ghi nhận cho thấy AgNPs có hiệu quả trong sự hình thành mô sẹo, sự tăng sinh mô sẹo, hình thái của các mô sẹo và số chồi lớn hơn 1,5 cm tạo tiền đề cho các giai đoạn tiếp theo.
Các kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó khi mẫu cấy tiếp xúc với AgNPs. Ewais và cộng sự trong nuôi cấy cây lu lu (Solanum nigrum), kết quả ghi nhận tỷ lệ hình thành mô sẹo (89%), khối lượng tươi của mô sẹo (4,67 g/mẫu cấy) và các mô sẹo xốp có màu trắng, xanh lục trên môi trường có bổ sung 8 mg/L AgNPs [57]. Spinoso-Castillo và cộng sự (2017) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt AgNPs (hình cầu, kích thước 35 nm, chứa 12 mg/L kim loại Ag) lên quá trình vi nhân giống thương mại cây thuộc họ lan (Vanilla planifolia) trong hệ thống ngập chìm tạm thời Rita. Các chồi này được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung AgNPs (0, 25, 50, 100 và 200 mg/L); sau 30 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy sự hình thành chồi, chiều dài chồi, khối lượng tươi, khối lượng khô cao nhất trên môi trường có bổ sung 25 và 50 mg/L AgNPs; sự ức chế đáng kể đã được ghi nhận khi bổ sung 100 và 200 mg/L AgNPs [149].
Tóm lại, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng AgNPs (kích thước ≤ 20 nm) ở nồng độ từ 0,2 g/L đến 0,5 g/L trong thời gian từ 15 phút đến 20 phút để khử trùng
bề mặt mẫu lá và có thể thay thế hoàn toàn chất khử trùng thông dụng là HgCl2 ở giai đoạn tạo nguồn mẫu in vitro. Sử dụng AgNPs nồng độ 0,2 g/L ở thời gian 20 phút cho hiệu quả khử trùng tối ưu nhất, mẫu lá cảm ứng tạo mô sẹo nhanh và phát triển tốt, không có dấu hiệu ức chế và không có ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển ở các