và cảm ứng mẫu cấy
Lá non của cây salem (3 tháng tuổi), dâu tây (3 tháng tuổi) và sâm Ngọc Linh (3 năm tuổi) được xử lý sơ bộ bằng cách rửa sạch dưới vòi nước máy. Sau đó các lá được đưa vào tủ cấy vô trùng và ngâm với cồn 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần. Các lá này tiếp tục được khử trùng bằng dung dịch AgNPs với các nồng độ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2; 0,5 g/L) trong các khoảng thời gian thay đổi (5; 10; 15; 20; 30 phút) và so sánh với nghiệm thức đối chứng là 1 g/L HgCl2 trong 5 phút trên đối tượng cây salem [83], dâu tây [122], sâm Ngọc Linh [53]. Những mẫu lá này sau khi khử trùng được rửa lại với nước cất khử trùng 3 lần và cắt thành hình tròn có đường kính 1 cm bằng dụng cụ cắt [11] dọc theo 2 bên gân chính của lá (không bao gồm gân chính). Các mẫu lá này được cấy trên các môi trường khác nhau với 30 bình thuỷ tinh (100 mL chứa 15 mL môi trường) trên 1 nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu.
Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem
Mẫu lá cây salem (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường ½MS có bổ sung 20 g/L sucrose; 1 mg/L picloram và 2,5 g/L gelrite [78]. Tỷ lệ nhiễm (%), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây
Mẫu lá dâu tây (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L TDZ, 0,1 mg/L IBA, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar [151]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu, chồi cao > 1,5 cm và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá sâm Ngọc Linh
Mẫu lá sâm Ngọc Linh (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,2 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar [15]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%), khối lượng tươi (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro
Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro
Mô sẹo xốp thu nhận từ thí nghiệm 1.1 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường lỏng ½MS có bổ sung 1 mg/L picloram và 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 5 bình tam giác (250 mL chứa 100 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,1 g mô sẹo xốp. Tất cả nghiệm thức được đặt trên máy lắc (Hermle, Ðức) với tốc độ 100 vòng/phút. Số lượng tế bào đơn được ghi nhận sau 4; 8; 12; 16; 20; 24; 28 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro
Huyền phù tế bào (0,5 mL) thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.1 được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L zeatin, 2,5 g/L gelrite, 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,5 mL thể tích huyền phù tế bào. Tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/bình, chiều cao chồi (cm), số chồi > 1,5 cm/bình và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi vô tính từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Mô sẹo thu nhận từ thí nghiệm 1.3 được cắt nhỏ (1,5 × 1,5 cm) với khối lượng khoảng 0,5 g và cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS có chứa 1 mg/L 2,4-D, 0,5 mg/L NAA, 0,2 mg/L Kin, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar [119] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 1mẫu. Số phôi/bình, số chồi, số chồi > 3 cm, khối lượng tươi (g), khối lượng khô (mg) được ghi nhận sau 14 tuần nuôi cấy.