Phương pháp khử trùng bề mặt mẫu cấy phổ biến là sử dụng các chất hoá học thông dụng [Ca(ClO)2, HgCl2, …] có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn, nhưng những chất này lại gây hại đối với mẫu cấy và con người. Vì vậy, thí nghiệm này nhằm tìm ra loại chất khử trùng ở nồng độ và thời gian phù hợp có hiệu quả cao trong khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy nhưng phải ít độc nhằm thay thế các chất khử trùng thông dụng.
Mẫu lá được khử trùng bằng HgCl2 đã xuất hiện nấm sau 1 tuần nuôi cấy; trong khi đó, mẫu lá khử trùng bằng AgNPs chưa ghi nhận được tỷ lệ nhiễm. Do đó, bước đầu có thể thấy AgNPs có hiệu quả khử trùng vượt trội hơn so với HgCl2. Sau 2 tuần nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn bắt đầu được ghi nhận ở các nghiệm thức khử trùng bằng AgNPs. Kết quả cho thấy, các mẫu lá khử trùng với 0,05 g/L AgNPs trong 5 – 10 phút và 0,1 g/L AgNPs trong 5 phút bị nhiễm nấm hoàn toàn (Bảng 3.1). Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm của mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút là thấp nhất (26,66%) trong thí nghiệm (Bảng 3.1). Bên cạnh đó, tỷ lệ nhiễm của các mẫu cấy được xử lý bằng AgNPs tăng khi thay đổi nồng độ hay thời gian khử trùng so với nồng độ tối ưu của AgNPs (0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút) (Bảng 3.1). Vì vậy, ở các nghiệm thức khử trùng bằng AgNPs sự thay đổi cả về nồng độ và thời gian đều có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả của quá trình khử trùng.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem sau 4 tuần nuôi cấy
Chất khử trùng Nồng độ (g/L) Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm và hoại tử (%) Tỷ lệ tái sinh mô sẹo (%) Khối lượng tươi (g) Hình thái mẫu AgNPs 0,05 5 100,00a* - - Mẫu nhiễm 10 100,00a - - 15 72,22b 27,77e 0,52e Mô sẹo xốp 20 71,11b 28,88e 0,53de
30 73,33b 26,66e 0,54cd Mô sẹo hoá nâu
0,1 5 100,00a - - Mẫu nhiễm 10 70,00b 30,00e 0,53de Mô sẹo xốp 15 68,89b 31,11e 0,54cd 20 46,66c 53,33d 0,64b
30 71,11b 28,88e 0,55c Mô sẹo hoá nâu
0,2
5 71,11b 28,89e 0,54cd
Mô sẹo xốp 10 45,55c 54,44d 0,64b
15 36,66de 63,33bc 0,73a
20 26,66f 73,33a 0,74a Mô sẹo xốp, màu trắng sữa
30 70,00b 30,00e 0,53de Mô sẹo hoá nâu
0,5
5 71,11b 28,89e 0,52e
Mô sẹo xốp 10 44,44cd 55,55cd 0,65b
15 26,66f 73,33a 0,73a Mô sẹo xốp, màu xanh
20 35,55e 64,44b 0,73a Mô sẹo xốp 30 68,89b 31,11e 0,53de Mô sẹo hoá nâu HgCl2 1 5 43,33cde 56,66bcd 0,64b Mô sẹo cứng,
ngả vàng
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Hình 3.1. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá salem được khử trùng bằng AgNPs so với HgCl2 sau 4 tuần nuôi cấy
a: mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút; b: mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 30 phút c: mẫu lá được khử trùng bằng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút; sau 4 tuần nuôi cấy.
Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh mô sẹo của mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút (73,33%) cao hơn so với các nghiệm còn lại (Bảng 3.1). Trong đó, tất cả các mẫu lá khử trùng bằng AgNPs có dấu hiệu cảm ứng mô sẹo sớm nhất trong tuần đầu tiên. Sau đó, các mẫu lá khử trùng bằng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cảm ứng mô sẹo sau tuần thứ ba trên cùng một môi trường thí nghiệm. Mặt khác, khối lượng tươi (0,73 – 0,74 g) của mô sẹo từ mẫu lá khử trùng với 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 15 – 20 phút cao hơn so với với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (0,64 g). Đặc biệt, mẫu lá khử trùng với 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho thấy sự phát triển của mô sẹo xốp có cấu trúc giống phôi, nhiều sơ khởi phôi có màu trắng sữa và xuất hiện rễ bất định là nguồn vật liệu tiềm năng cho quá trình phát sinh phôi hay huyền phù tế bào (Hình 3.1a); 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút cho thấy sự phát triển của mô sẹo xốp có cấu trúc giống phôi, nhiều sơ khởi phôi có màu xanh. Các mẫu lá ở các nồng độ AgNPs còn lại cho thấy có sự xuất hiện các mô sẹo xốp với các mức độ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ AgNPs và thời gian xử lý mẫu cấy. Bên cạnh đó, ở nồng độ 1 g/L HgCl2 trong 5 phút là các mô sẹo cứng có màu ngả vàng (Hình 3.1c). Ngoài ra, mẫu lá ở tất cả các nồng độ AgNPs trong thời gian 30 phút có sự ức chế sau 4 tuần nuôi cấy; mẫu bị hoá nâu và hoại tử (Hình 3.1b). Vậy, có thể thấy ở các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs trong thời gian dài sẽ gây hiện tượng ức chế mẫu cấy.
Như vậy, khi xử lý mẫu cấy bằng AgNPs ở nồng độ từ 0,2 g/L trong 20 phút và 0,5 g/L trong 15 phút không chỉ có hiệu quả cao trong khử trùng mẫu cấy mà còn có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu lá cây salem.