III. Một số kĩ thuật phục vụ cho SSCHT 3.1 Bảo quản tinh trùng [3]
3.4. Trữ lạnh phôi [2], [8], [11]
- Hiện nay, kỹ thuật điều trị vô sinh bằng thụ tinh trong ống nghiệm gắn liền với kích thích buồng trứng nhằm thu được nhiều trứng, tạo được nhiều phôi qua đó có được một số phôi tốt để chuyển trở lại vào tử cung của người mẹ. Kích thích buồng trứng sẽ có khả năng thừa phôi, nhưng nếu không kích thích buồng trứng thì tỷ lệ điều trị thành công sẽ thấp do ít phôi tốt. Mặt khác, nếu chuyển nhiều phôi sẽ tăng tỷ lệ đa thai, nhưng nếu đơn thuần hủy phôi thừa là điều đáng tiếc, thậm chí bị cấm ở một số quốc gia. Trước những mâu thuẫn đó trữ phôi để chuyển sau này có thể xem là câu trả lời thích hợp nhất.
- Phôi động vật đầu tiên được trữ thành công là phôi chuột vào năm 1972. Tiếp sau đó, kỹ thụật trữ phôi được phát triển và áp dụng cho trữ phôi gia súc. Mãi đến năm 1983 phôi người đầu tiên mới được trữ thành công. Trong một thời gian ngắn kỹ thuật trữ phôi được nghiên cứu phát triển, các quy trình trữ được đơn giản và tối ưu hóa. Kể từ đó, kỹ thuật trữ phôi trở thành một bộ phận không thể thiếu của kỹ thuật điều trị vô sinh bằng thụ tinh trong ống nghiệm.
- Xét về tính chất, so với trữ phôi thì trữ trứng giúp hạn chế được những rắc rối pháp lý về quyền sở hữu phôi cũng như giúp cho việc cho trứng đơn giản và an toàn hơn. Tuy nhiên xét về kỹ thuật, mặc dù trữ trứng động vật cũng như trứng người đã được thực hiện thành công,
hiệu quả của kỹ thuật này vẫn còn rất thấp .Vào thời điểm hiện nay chỉ có kỹ thuật trữ phôi là khả thi để áp dụng trên lâm sàng.
- Như chúng ta đã biết, trữ lạnh mô hay trữ lạnh tế bào là để bảo tồn nó cho tương lai. Với những kỹ thuật hiện nay, trữ lạnh phôi là một trong những phương pháp hỗ trợ hiệu quả trong qúa trình điều trị vô sinh cho những trường hợp bệnh nhân có phôi dư sau chu kỳ chuyển phôi tươi.
Nguyên lý trữ lạnh phôi: Hiện nay trên thế giới áp dụng kỹ thuật trữ lạnh phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa. Với kỹ thuật này, sự thành công phụ thuộc vào việc loại bỏ nước được hình thành trong các tế bào của phôi trong quá trình trữ lạnh. Nếu nước còn sót lại trong tế bào, nó sẽ hình thành nên các “tinh thể nước đá”, chính những “tinh thể nước đá” này sẽ họat động như những “con dao” và nó sẽ phá hủy bên trong tế bào hoặc “cắt” đứt làm vỡ màng của tế bào. Như vậy phôi sẽ không có khả năng sống sau rã. Để tránh sự hình thành tinh thể nước đá trong phôi, kỹ thuật trữ lạnh phôi bằng phương pháp thủy tinh hóa có “chất bảo vệ” được thêm vào để thay thế hầu hết các nước có trong phôi. “Chất bảo vệ” sẽ ngăn ngừa hình thành tinh thể nước đá, nên phôi sẽ được an toàn trong quá trình trữ lạnh. Khi phôi được lấy ra từ các thùng trữ lạnh để sử dụng, “chất bảo vệ” sẽ được loại bỏ khỏi tế bào phôi để thay thế bằng nước. Mặc dù phôi trong có vẻ khỏe mạnh, nhưng nó có thể không di chuyển được nước và “chất bảo vệ” vào và ra khỏi tế bào một cách hiệu quả. Nếu điều này xảy ra ở một phần của
phôi hoặc tòan bộ phôi thì số phôi đó không có khả năng sống trong quá trình trữ và rã phôi.
* Những thay đổi bên trong tế bào khi làm lạnh
Để đạt được nhiệt độ trữ, tế bào sống phải được làm lạnh từ nhiệt độ sống (thân nhiệt đối với tế bào động vật) xuống đến -1960C. Quá trình này gây ra một số thay đổi trong môi trường và cả trong tế bào có khả năng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tế bào được trữ:
Giảm tốc độ hoạt động của enzyme. Khi nhiệt độ giảm từ 37oC xuống còn 7oC, hoạt động của enzyme giảm 8 lần.
Giảm độ hòa tan của các khí trong môi trường. Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO2 làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng hòa tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng làm tổn hại đến tế bào.
Hình thành tinh thể nước đá. Nước trong môi trường khi lạnh dưới 00C khoảng 10-150C sẽ dần kết tinh thành những tinh thể nước tinh khiết. Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hòa tan cũng như chất bảo quản lạnh có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan.
Tăng nồng độ chất hòa tan trong môi trường. Đây là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Khi nước chuyển sang dạng tinh thể tinh khiết, lượng nước ở thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ các chất hòa tan tăng lên gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu, kéo nước từ bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng lipoprotein của tế bào.
Tăng nhiệt độ tiềm ẩn. Đây cũng là một hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Phân tử nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng. Nếu nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0oC. Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau khi rã đông.
* Biện pháp hạn chế tác động của làm lạnh: Để giải quyết những tác động gây nên trong quá trình làm lạnh nêu trên, ba biện pháp kỹ thuật chính được sử dụng:
+ Kiểm soát tốc độ làm lạnh. Tốc độ làm lạnh càng nhanh thì tinh thể tạo ra bên trong tế bào càng nhiều. Tùy theo thể tích và diện tích màng bào tương mà mỗi loại tế bào có tốc độ làm lạnh để trữ tối ưu khác nhau. Với tế bào trứng và phôi người, tốc độ tối ưu theo nghiên cứu là 0,30C/phút. Tốc độ này cho phép sự trao đổi nước qua màng có thể diễn ra trước khi hoàn toàn chuyển thành thể rắn.
+ Sử dụng chất bảo quản lạnh. Nếu làm lạnh càng chậm thì giảm được sự hình thành tinh thể bên trong tế bào, giảm tổn thương bào quan. Tuy nhiên thời gian tế bào tiếp xúc với môi trường có nồng độ
chất hòa tan cao càng lâu thì tế bào càng bị tổn thương màng bào tương. Để giải quyết mâu thuẫn này, chất bảo quản lạnh được đưa vào sử dụng. Đây là những chất tan trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào. Với những tính chất này, chất bảo quản xâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào, giúp làm giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào và giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đá.
Do không tạo thành tinh thể, chất bảo quản lạnh hạn chế sự gia tăng nồng độ của chất hòa tan. Nó còn kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào. Tuy nhiên, những ghi nhận về hiệu quả của từng loại chất bảo quản khác nhau lên từng loại tế bào khác nhau (ví dụ như phôi ở những giai đoạn khác nhau) chỉ dựa trên quan sát thực tế, cơ chế chưa được chứng minh. Bốn loại chất bảo quản lạnh hiện đang được sử dụng trong trữ phôi là Glycerol, Dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol (hay propylen glycol) và 1,2-ethanediol (hay ethylene glycol). Đây là những chất bảo quản lạnh nội bào vì có khả năng xâm nhập tế bào.
Một số đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được xem như những chất bảo quản lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản lạnh nội bào. Các chất này (thường là mono-, di- hoặc tri- saccharide) có tác dụng làm giảm áp lực thẩm thấu bên ngoài tế bào, đồng thời giúp giảm lượng nước bên trong tế bào để giảm tổn thương do hình thành tinh thể nước đá.
Khởi phát sự tạo thành tinh thể nước đá. Biện pháp này nhằm hạn chế sự tăng nhiệt độ tiềm ẩn do các tinh thể nước được tạo điều kiện để hình thành dần dần. Ở khoảng -70C, môi trường được cho tiếp xúc một vật có nhiệt độ rất lạnh. Tinh thể nước đá hình thành từ điểm tiếp xúc sẽ kích thích hình thành các tinh thể khác dần dần lan tỏa khắp môi trường. Kỹ thuật này được gọi là tạo mầm tinh thể, giúp hạn chế hiện tượng tăng nhiệt độ tiềm ẩn qua đó tránh được tác động của tăng nhiệt độ tiềm ẩn.
* Ảnh hưởng của bảo quản và rã đông: Như đã trình bày trong phần trước, tế bào có thể được bảo quản ở tình trạng đông lạnh trong nhiều năm. Quá trình rã đông đưa tế bào từ nhiệt độ bảo quản là - 196oC trở lại nhiệt độ sống ban đầu của tế bào. Qui trình rã đông có liên hệ chặt chẽ với qui trình làm lạnh, hay cụ thể hơn là phụ thuộc vào lượng tinh thể nước đá còn lại bên trong tế bào. Hiện tượng tái kết tinh hóa xảy ra trên những tinh thể này khi rã đông có khả năng tạo nên những tinh thể lớn làm tổn thương tế bào. Do vậy tốc độ rã đông phải đủ nhanh để hạn chế hiện tượng tái kết tinh hóa xãy ra.
Mặc khác, tốc độ rã đông lại không được quá nhanh để nước có thể kịp trở lại vào bên trong tế bào. Với việc sử dụng chất bảo quản lạnh, phác đồ làm lạnh và rã đông đối với phôi đã được đơn giản hóa, thời gian thực hiện cũng được rút ngắn. Ứng với tốc độ làm lạnh 0,3oC/phút thì tốc độ rã đông có thể đạt tới 30oC/phút. Cuối cùng phôi được rửa sạch các chất bảo quản lạnh để tiếp tục nuôi cấy trong môi trường.
* Làm lạnh cực nhanh (Vitrification): Đây là kỹ thuật mới ứng dụng hiện tượng đông đặc của nước khi giảm nhiệt độ thật nhanh. Khi này nước không chuyển thành nước đá (ice) thông qua thành lập tinh thể nước đá (crystallization) mà chuyển thành dạng kính (glass). Ở dạng kính, phân tử nước cũng như các chất hòa tan khác được giữ nguyên vị trí. Kỹ thuật này có ưu điểm là giúp tế bào trữ lạnh tránh được những tổn thương do hiện tượng hình thành tinh thể nước đá gây ra.
Tuy nhiên chất bảo quản với được dùng trong kỹ thuật này có nồng độ rất cao, có khả năng gây nên những tổn thương về cấu trúc di truyền cho tế bào. Có lẽ đây là lý do tại sao phôi sau trữ có cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuôi trong ống nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất thấp. Người ta cho rằng thành công của phương pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá. Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực tế nhưng tiềm năng của nó rất lớn vì tính đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm đang được sử dụng.
* Trữ phôi gian đoạn sớm: Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay cho giai đoạn này là 1,2 propanediol (PROH). Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) là loại chất bảo quản lạnh được sử dụng thành công đầu tiên ở người nhưng phác đồ dùng DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh cũng như rã đông nên ít được dùng hơn.
Với PROH, kết quả đạt được tốt nhất khi dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản bên ngoài tế bào.
Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường cấy phôi có bổ sung 20% huyết thanh. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và sucarose trong từng môi trườnglà:
- Làm lạnh1:1,5 MPROH (15phút)
- Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucarose (5 phút)
Sau đó phôi được cho vào các ống trữ thể tích khoảng 0,25ml và trữ theo chương trình:
- Từ nhiệt độ phòng xuống -70C: giảm 1-20C/phút
- Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước khi chạm vào thành ống trữ phôi
- Giai đoạn làm lạnh chậm đến -300C: giảm 0,30C/phút
- Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-500C/phút, hoặc có thể cho trực tiếp vào nitơ lỏng.
Đến lúc này phôi được giữ liên tục trong nitơ lỏng. Chỉ đến lúc sử dụng phôi mới được rã đông. Với chất bảo quản lạnh là PROH, ống chứa phôi có thể được làm rã đông bằng cách giữ trong không khí trong 30 giây, sau đó nhúng vào nước ấm 37oC trong 60 giây. Ngược với trước khi làm lạnh, sau khi rã đông, phôi lại được chuyển lần lượt qua các môi trường khác nhau để rửa sạch chất bảo quản lạnh vốn có thể
gây độc cho phôi. PROH có nồng độ giảm dần để tránh sự thoát nước quá nhanh ra khỏi phôi.
Thời gian phôi được giữ trong mỗi môi trường ra đông là 5 phút: - Rã đông 1: 1M PROH – 0,2M sucrose
- Rã đông 2: 0,5M PROH – 0,2M sucrose - Rã đông 3: 0,25M PROH – 0,2M sucrose - Rã đông 4: 0M PROH – 0,2M sucrose
Sau môi trường rã đông 4, phôi được cho trở lại vào môi trường cấy. Chất lượng phôi sau khi rã đông được kiểm tra sau 1 giờ. Ở một số trung tâm, phôi sau khi rã đông được nuôi cấy 1 ngày để xem khả năng phát triển của phôi trước khi chuyển trở lại vào buồng tử cung.
* Trữ phôi giai đoạn muộn: Các bước trữ phôi cũng tương tự như trữ phôi giai đoạn sớm. Tuy nhiên chất bảo quản lạnh là Glycerol. Nồng độ glycerol dùng trước khi làm lạnh là:
- Làm lạnh 1: Glycerol 5% (10 phút)
- Làm lạnh 2: Glycerol 9% trong môi trường chứa sucrose (10 phút)
• Môi trường sau khi rã đông là: - Sucrose 0,5M (10 phút) - Sucrose 0,2% (10 phút)
* Đánh giá hiệu quả trữ phôi: Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng sống của phôi sau khi rã đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy và
cấp độ thứ ba là khả năng phát triển của phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ.
+ Ở cấp độ 1, phôi được đánh giá về hình dạng 1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống (survival index) tính bằng tỷ lệ tế bào còn sống trên tổng số tế bào.
+ Cấp độ 2 đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống trên tổng số phôi được rã đông.
+ Cấp độ 3, cũng là cấp độ quan trọng nhất, là tỷ lệ phôi làm tổ sau khi chuyển.
So với trữ phôi giai đoạn sớm, trữ phôi giai đoạn muộn có tỷ lệ sống sau trữ lớn hơn do thể tích tế bào trong phôi nhỏ hơn. Tuy nhiên khó khăn cơ bản là phải có được phôi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải nuôi cấy phôi đến được giai đoạn phôi nang (blastocyst). Để đạt được điều này, một mặt bệnh nhân phải có nhiều phôi, mặt khác quy trình nuôi cấy phôi phải thật tốt. Hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu đối chứng đủ mạnh để so sánh hiệu quả của trữ phôi giai đoạn sớm và giai đoạn muộn. Thực tế cho thấy ở những quốc gia không cho phép trữ phôi giai đoạn muộn như Đức, việc trữ phôi ngay cả ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus) vẫn có giá trị lâm sàng.
* Những điểm cần lưu ý trong kỹ thuật trữ lạnh:
Tạo mầm tinh thể: đây là bước quyết định thành công của kỹ thuật làm lạnh chậm. Mặc dù hiện nay các máy làm lạnh đều có tùy chọn tạo