ĐỐI TƯỢN G NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4. Các phương pháp phân tích hóa sinh
3.3.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu được được xác định bằng phương pháp Folin- Ciocalteu theo Singleton et Rossi, 1965.
• Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng oxi hóa các hợp chất polyphenol bằng thuốc thử Folin- Ciocalteu tạo ra sản phẩm màu xanh thẫm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ polyphenol trong một phạm vi nhất định. Căn cứ vào cường độ màu đo trên máy so màu ở bước sóng 755nm và đồ thị chuẩn của acid galic với thuốc thử này có thể xác định được hàm lượng polyphenol trong mẫu quả sim.
• Tiến hành phản ứng trong ống nghiệm theo tỉ lệ các chất như sau: + 0,5 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 1N
+ 1ml dung dịch mẫu cần phân tích đã pha lỗng đến nồng độ thích hợp để độ hấp thụ nằm trong khoảng 0.1 đến 1.0.
+ 2,5ml Na2CO3 7,5%
Dựng máy vontex cho dung dịch đồng nhất trong ống nghiệm, để yên trong bóng tối cho ổn định màu rồi đem đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 755nm. Từ kết quả thu được và đường chuẩn acid galic (Hình 3.2) ta tính được hàm lượng polyphenol trong 1g chất khô quả sim và được biểu diễn theo mgGAE/gCK (GAE- Gallic Acid Equivalent).
3.3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin tổng số
Hàm lượng anthocyanin tổng số được xác định bằng phương pháp PH vi sai (Giusti et al, 2002).
• Ngun tắc: Chất màu anthocyanin có độ hấp thụ màu thay đổi theo pH. Tại pH=1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp phụ cực đại, cịn ở pH= 4.5 thì chúng ở dạng bazơ cacbinol hay chalcon khơng màu (Huỳnh Thị Cúc & cs, 2004).
Cách pha đệm pH 1 và pH 4.5:
• Đệm pH= 1: Cân 1.86g KCl và 980 ml nước cất, chuẩn dung dịch về pH=1 bằng HCl gốc sau đó lên thể tích 1 lít bằng nước cất.
• Đệm pH= 4.5: Cân 54.43g CH3COONa.3H2O và 960 ml nước cất, chuẩn dung dịch về pH= 4.5 bằng HCl gốc sau đó lên thể tích 1lít bằng nước cất.
Pha loãng dịch chiết trong dung dịch đệm và đo
+ Pha loãng dịch chiết trong các dung dịch đệm pH=1 và pH=4.5 với hệ số pha loãng là 10.
+ Vontex cho dung dịch đồng nhất
+ Để 30 phút và đem đo độ hấp thụ quang tại 2 bước sóng 520nm và 700nm.
Hàm lượng anthocyanin được tính theo cơng thức: TAC (mg/g)=A* MV* DF/ε/1
Trong đó:
A= (A520 – A700)pH1 – ((A520 – A700)pH4.5 MW= 449.2 g/mol
DF: Hệ số pha loãng
ε = 26.900 l/mol/cm: hệ số hấp thụ phân tử của cyanindin 3- glucosid l : chiều dài cuvet (l= 1cm)
Hàm lượng anthocyanin tổng số được biểu diễn theo mg cyanindin- 3- glucosid/g chất khô mẫu. Đây là anthocyanin phổ biến trong tự nhiên.
3.3.4.3. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa
Khả năng kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp DPPH (Tabart et al, 2009).
•Nguyên tắc: DPPH – Diphenylpicrylhydrazyl là gốc tự do có màu tím, nhiều nghiên cứu đã chứng minh độ hấp thụ quang cực đại là Amax = 517nm. Khi cho dung dịch chất có khả năng kháng oxy hóa vào dung dịch DPPH thì các gốc tự do mất màu tím, dung dịch làm mất màu tím càng nhạt thì khả năng kháng oxy hóa càng cao. Dựa vào khả năng làm mất màu tím gốc tự do DPPH của dịch chiết polyphenol từ quả sim ta xác định được khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết polyphenol từ quả sim.
ãTrong ng nghim cú:
+ 150àl dch chit ó pha lỗng đến nồng độ thích hợp + 3850µl DPPH 1µmol/lít
+ Tiến hành đồng thời một mẫu control thay dịch chiết bằng methanol Vortex cho dung dịch đồng nhất trong ống nghiệm, đặt ống nghiệm ở điều kiện 250C trong 30 phút rồi đem đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 517nm.
% kìm hãm được xác định bằng cơng thức: % kìm hãm = (ODcontrol - ODmẫu) * 100
ODcontrol
Trong đó: ODcontrol: Độ hấp thụ quang của mẫu contol ODmẫu: Độ hấp thụ quang của mẫu
Trolox một dẫn xuất của vitamine E được dùng làm chất chuẩn trong test này.Khả năng kháng oxi hóa của quả dựa trên đường chuẩn mơ tả mối quan hệ giữa % kìm hãm và nồng độ trolox.
Hình 3.3. Đường chuẩn trolox
3.3.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng flavon và flavonol tổng số
Hàm lượng flavon và flavonol tổng số được xác định bằng phương pháp tạo phức màu với AlCl3 (Chang et al, 2002)
• Nguyên tắc: Phản ứng dựa trên sự tạo phức màu giữa các nhóm xeton và hydroxyl của flavon và flavonol với Al. Phức này có màu vàng và hấp thụ cực đại tại A415nm.
• Trong ống nghiệm có: + 500μl mẫu + 1500μl ethanol 95% + 100μl AlCl3 + 100μl CH3COOK 1M + 2.8ml H2O
Sau đó votex cho dung dịch đồng nhất trong ống nghiệm để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và đem đo độ hấp thụ tại bước sóng A415nm. Tiến hành đồng thời mẫu đường chuẩn bằng cách thay 100μl AlCl3 bằng 100μl nước.
Quercetin được dùng làm chất chuẩn trong test này. Hàm lượng flavonol tổng số được xác định dựa trên đường chuẩn mô tả mối quan hệ giữa nồng độ Quercetin (mg QE/g CK) và độ hấp thụ quang tại bước sóng A415nm.
Hình 3.4. Đường chuẩn Quercetin
3.3.4.5. Phương pháp xác định hàm lượng proanthocyanin
• Nguyên tắc: Các hợp chất proanthocyanin hay còn gọi là tanin ngưng tụ dưới tác dụng của butanol acid sẽ bị phân giải theo cách oxi hóa tạo thành các nhân anthocyanindin. Sự chênh lệch của nồng độ các nhân cyanindin sau và trước phân giải bằng butanol acid chính là lượng nhân anthocyanindin giải phóng từ tanin ngưng tụ.
•Cách tiến hành:
+ 3000μl butanol- HCl đặc (95: 5 v/v) + 500μl dịch chiết
+ Tiến hành đồng thời 1 mẫu trắng thay dịch chiết bằng dung môi aceton: nước: acid acetic= 50: 49: 1
+ Để yên 1h ở nhiệt độ phòng
+ Vontex cho dung dịch đồng nhất đem đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 550nm.
+ Làm tương tự đun sôi trong 1h và đem đo độ hấp thụ quang + Tính hiệu độ hấp thụ quang của mẫu đun sôi và không đun sôi
Cyanidin chlorid được dùng làm chất chuẩn trong test này. Hàm lượng proanthocyanin tổng số được xác định dựa vào đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa Cyanidin Chlorid (mg CCE/g CK- mg Cyanidin chlorid equivalent/g chất khơ) và độ hấp thụ quang tại A550nm.
Hình 3.5. Đường chuẩn Cyanindin Chlorid
3.3.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng flavan-3ol tổng số
Hàm lượng flavan-3ol tổng số được xác định bằng phương pháp DMACA (Quettier- Deleu et al, 2000).
•Nguyên tắc: Phản ứng dựa trên sự tạp phức màu giữa các hợp chất flavan- 3ol và DMACA. Phức có màu xanh lá cây và độ hấp thụ cực đại tại A640nm.
• Cách tiến hành:
+ 600μl dịch chiết đã pha loãng 5 lần + 3 ml DMACA (0,5g/l)
Sau đó vontex và đặt tại điều kiện thường trong 10 phút, đem đo tại bước sóng A640nm. Tiến hành đồng thời mẫu trắng thay 600μl dịch chiết bằng 600μl HCl 0.5%.
Catechin được dùng làm chất chuẩn trong test này. Hàm lượng flavonol tổng số được xác định dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ của Catechin μg/ml và độ hấp thụ quang tại bước sóng A640nm.
Hình 3.6. Đường chuẩn Catechin (μg/ml) 3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi mẫu được chiết 3 lần. Mỗi test thử lặp lại 2 lần, kết quả không sai khác nhau quá 5%. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Exel 2003 và SAS 9.0.
PHẦN IV