- Tế bào lỏch cỏ mỳ dũng GS
3.1.4. Kết quả xỏc định loài dựa trờn trỡnh tự gen mó húa khỏng nguyờn của NNV phõn lập
của NNV phõn lập
Bệnh hoại tử thần kinh ở cỏ mỳ khụng phải là bệnh mới xuất hiện ở Việt Nam, tuy nhiờn đõy là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở cỏ, cú khả năng tạo thành dịch nếu cụng tỏc kiểm soỏt dịch bệnh khụng tốt. Để thận trọng
trong việc xỏc định loài gõy bệnh ở cỏ mỳ nhằm tạo cơ sở cho cụng tỏc kiểm soỏt an toàn dịch bệnh trờn cỏ, gen T2 mó húa khỏng nguyờn đặc hiệu của NNV được giải trỡnh tự để xỏc định chớnh xỏc loài.
RNA tổng số của NNV được tỏch chiết theo kit RNeasy Qiagen (Invitrogen, Mỹ) được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1% và đỏnh giỏ độ sạch bằng mỏy quang phổ.
Bước tỏch RNA tổng số rất quan trọng và ảnh hưởng nhiều đến kết quả của phản ứng RT-PCR. Phản ứng RT-PCR muốn đạt hiệu quả cao thỡ ARN tổng số tỏch được phải đạt một số chỉ tiờu về độ tinh sạch và độ nguyờn vẹn. Mẫu ARN sau khi tỏch chiết được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước súng 260nm và 280 nm.
Hỡnh 3.4. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trờn gel agarose 1%
(Giếng M: DNA chuẩn 12kb; giếng 1: ảnh điện di sản phẩm RNA tổng số; giếng 3: ảnh điện di sản phẩm RNA tổng số; giếng 3: ảnh điện di sản phẩm RNA tổng số)
Kết quả trờn bản điện di cho cả 3 mẫu ARN của NNV đều xuất hiện duy nhất 1 băng rừ nột (hỡnh 3.4), cú kớch thước khoảng 4,5 kb chứng tỏ ARN cú độ nguyờn vẹn và tinh sạch tương đối cao, đủ tiờu chuẩn để thực hiện cỏc bước tiếp theo của quỏ trỡnh tỏch dũng gen.
Sau khi tỏch chiết được RNA tổng số, RNA được sử dụng làm khuụn cho phản ứng tạo cDNA bằng bộ sinh phẩm Qiagen OneStep RT-PCR Kit với cặp mồi F2-R3 cú trỡnh tự như sau: F2: 5'- CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-
3’, R3: 5’- CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3’. Sản phẩm RT- PCR được kiểm tra trờn gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện ở hỡnh 3.5
Hỡnh 3.5. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trờn gel agarose 1%
(Giếng M: DNA chuẩn 12kb; giếng 1: sản phẩm RT-PCR; giếng 1: sản phẩm RT- PCR; giếng 2: sản phẩm RT-PCR; giếng 3: sản phẩm RT-PCR; giếng 4: đối chứng khụng sử dụng mồi cho phản ứng PCR; giếng 5: đối chứng khụng sử dụng enzyme Taq-polymerase cho phản ứng PCR; giếng 6: đối chứng khụng bổ sung template cho
phản ứng PCR)
Kết quả trờn cho thấy đoạn RNA mang T2 mó húa khỏng nguyờn vỏ của Nervous Necrosis Virus (NNV) đó được nhõn lờn một cỏch đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất.
Kết quả ở hỡnh 3.5 cho thấy rằng: giếng chạy sản phẩm PCR khụng cú mồi khụng xuất hiện vạch điện di, điều này cú nghĩa là nồng độ mồi là thớch hợp để thực hiện phản ứng, giếng chạy sản phẩm PCR khụng bổ sung template khụng xuất hiện vạch điện di, cú nghĩa là phản ứng PCR khụng tạo ra cỏc sản phẩm khụng đặc hiệu. Cỏc giếng điện di từ 1-3 xuất hiện duy nhất 1 vạch sản phẩm, cú kớch thước khoảng 421bp, tương đương theo kớch thước lý thuyết của đoạn gen T2. Kết quả này cũng tương đồng với bỏo cỏo của Chi và
cộng sự, 1999). Như vậy chỳng tụi cho rằng đoạn gen T2 đó được khuếch đại thành cụng và đạt tiờu chuẩn để tỏch dũng phục vụ cụng tỏc giải trỡnh tự gen.
Quỏ trỡnh tỏch dũng gen T2 được thực hiện bằng bộ kit TOPOđ TA Cloning Kit của hóng Invitrogen, trong đú:
- Vector tỏch dũng là vector pCR 2.1 - Enzyme cắt giới hạn là EcoR I - Enzyme nối là: T4-ligase
- Chủng tỏch dũng là: E.coli DH5α
Vector tỏch dũng tỏi tổ hợp được tạo thành nhờ phản ứng liờn kết nối đoạn gen đớch T4 vào vector pCR 2.1 với sự xỳc tỏc của enzyme T4- DNA ligase. Enzyme này cú khả năng nối hai trỡnh tự cả đầu so le và đầu bằng. Mẫu được ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đõy là nhiờt độ thớch hợp nhất cho enzyme T4- ligase hoạt động.
Phản ứng gắn gen đớch T2 vào vector xảy ra một cỏch ngẫu nhiờn nờn sản phẩm của phản ứng cú thể được tạo ra theo một số khả năng khụng mong muốn sau:
• Thứ nhất: Sự đúng vũng ngẫu nhiờn của vector.
• Thứ hai: Cỏc vector nối lại với nhau tạo nờn một plasmid cú kớch thước lớn.
• Thứ ba: sản phẩm PCR khụng đặc hiệu (khụng mang gen mó húa khỏng nguyờn vỏ của NNV) cũng được gắn vào vector, tạo ra vectơ tỏi tổ hợp khụng mong muốn, gõy khú khăn trong quỏ trỡnh chọn dũng.
Vector tỏi tổ hợp mong muốn sẽ là vector pCR2.1 được gắn với sản phẩm PCR cú gen T2 mó húa khỏng nguyờn vỏ của NNV.
Vector tỏi tổ hợp được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương phỏp sốc nhiệt. Nhờ bộ mỏy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tỏi tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn cỏc bản sao.
Theo thiết kế, vector pCR 2.1 cú chứa gen LacZ mó húa β- galactosidase, cho phộp dễ dàng phỏt hiện vector tỏi tổ hợp một cỏch đơn giản bằng quan sỏt màu sắc khuẩn lạc trờn mụi trường LB thạch cú bổ sung X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside) với nồng độ 100μg/ml. Trong mụi trường chọn lọc, nếu khụng cú gen ngoại lai được gắn vào vector, lỳc đú gen LacZ tổng hợp nờn β-galactosidase, phõn hủy X-gal từ hợp chất khụng màu thành màu xanh. Trong khi đú, nếu gen ngoại lai được gắn vào vector tức cài xen vào giữa gen LacZ thỡ lỳc đú gen LacZ khụng cú khả năng tổng hợp β-galactosidase nờn khụng cú phõn hủy X-gal, khuẩn lạc xuất hiện trờn đĩa thạch cú màu trắng (hỡnh 3.6).
Hỡnh 3.6. Kết quả biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α Tuy nhiờn, khụng phải tất cả cỏc khuẩn lạc trắng đều mang DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa đoạn gen mó húa cho khỏng nguyờn vỏ của NNV. Điều này cú thể do, gen LacZ bị mất chức năng mó húa cho enzym β- galactosidase nờn khụng phõn hủy được X-gal, khuẩn lạc cú màu trắng. Dự vậy, việc chọn lọc cỏc khuẩn lạc trắng để tỏch chiết DNA plasmid cú khả năng loại bỏ được phần lớn cỏc trường hợp khụng mong muốn.
Kết quả tạo vector và chủng E.coli DH5α tỏi tổ hợp gen T2 được đỏnh giỏ theo hai hướng, bao gồm: thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi F1, R3 và sử dụng enzyme cắt giới hạn. Kết quả thể hiện trong hỡnh 3.7
Theo thiết kế của vector tỏch dũng pCR 2.1, enzym EcoR I cú hai vị trớ cắt ở liền kề hai bờn vị trớ cắt mở vũng. Vỡ vậy, nếu sản phẩm RT-PCR được gắn vào vector thỡ sau khi thực hiện phản ứng cắt bằng enzym EcoR I sẽ xuất hiện 2 băng, một băng cú kớch thước tương ứng với kớch thước của vector pCR 2.1 (3,9kb), một băng cú kớch thước tương ứng với kớch thước của sản phẩm RT-PCR.
Hỡnh 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI
(Giếng M: DNA chuẩn 12 kb; Giếng 1-3: điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F2-R3; từ giếng 4-6: điện di sản phẩm cắt plasmid tỏch từ khuẩn lạc trắng; từ giếng 7-8: điện
di sản phẩm cắt plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh)
Hỡnh ảnh điện di trong hỡnh 3.7 cho thấy: trờn cỏc dũng 1, 2, 3, 4, 5, 6 cú chứa một vạch điện di, kớch thước khoảng 421bp tương đương với kớch thước của đoạn gen T2 của NNV; ở cỏc dũng 4, 5, 6 cũn cú thờm 1 vạch kớch thước 3,9 kb, tương đương với kớch thước của vector pCR 2.1 gốc. Cỏc giếng chạy sản phẩm tỏch chiết từ khuẩn lạc xanh khụng xuất hiện vạch điện di.
Như vậy, trong tế bào vi khuẩn E.coli DH5α của khuẩn lạc trắng cú chứa đoạn DNA cú cựng trọng lượng với đoạn gen T2 của NNV và cú
plasmid tỏi tổ hợp chứa đoạn này, chứng tỏ đoạn gen T2 đó được gắn thành cụng vào vector pCR 2.1 và vector tỏi tổ hợp PCR-T2 đó được chuyển vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coli DH5α.
Đoạn gen T2 trờn bản gel điện di được tỏch chiết bằng bộ Kit TOPOđ TA Cloning (Invitrogen) để thực hiện giải trỡnh tự. Kiểm tra kết quả thụi gel chỳng tụi thu được kết quả trong hỡnh 3.8.
Hỡnh 3.8. Kết quả tinh sạch DNA plasmid tỏi tổ hợp
(Giếng M: DNA chuẩn 12kb; giếng 1: DNA plasmid dũng 4; giếng 2: DNA plasmid dũng số 5; giếng 3: DNA plasmid tỏch dũng 6)
Qua hỡnh chỳng ta thấy, cỏc DNA plasmid này đảm bảo độ tinh sạch cũng như nồng độ cho phản ứng giải trỡnh tự gen. Bằng mỏy giải trỡnh tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trỡnh được thực hiện theo Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, trỡnh tự đoạn gen T2 thu được như sau: Atggtacgcaaaggtgagaagaaattggcaaaacccgcgaccaccaaggccgcgaatccgcaacc ccgccgacgtgctaacaatcgtcggcgtagtaatcgcactgacgcacctgtgtctaaggcctcgactgtaact ggattcggacgtgggaccaatgacgtccatctctcaggtatgtcgagaatctcccaggccgtcctcccagccg ggacaggaacagacggatacgttgttgttgacgcaaccatcgtccccgacctcctgccacgactgggacacg xlix
ctgctagaatcttccagcgatacgctgttgaatcactggagtttgaaattcagccaatgtgccccgcaaacac gggcggtggttacgttgctggcttcctgcctgatccaactgacaacgatcacaccttcuga
Sử dụng phần mềm Blast để xỏc định mức độ tương đồng của trỡnh tự gen T2 thu được với cỏc trỡnh tự của NCBI Genebank cho thấy đoạn gen này cú độ tương đồng là 99% với trỡnh tự gen mó húa khỏng nguyờn vỏ của NNV trờn RNA2 (bảng 3.4).
Bảng 3.4. So sỏnh mức độ tương đồng của trỡnh tự đoạn gen T2 thu được với cỏc trỡnh tự của GeneBank Mó số GeneBank Tờn chủng và gen xỏc định trỡnh tự Phần trăm trỡnh tự được so sỏnh với GeneBank (%) Mức độ tương đồng (%) AF318942.1
Epinephelus tauvina nervous necrosis virus segment RNA2 coat protein mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
DQ116036.1
Redspotted grouper nervous necrosis virus isolate SGNNV-Korea coat protein mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
DQ116035.1
Redspotted grouper nervous necrosis virus isolate RBNNV-Korea coat protein Mrna, complete cds
100 (%) 99 (%)
HQ859945.1
Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0809-Tuaran-
Malaysia-1 coat protein (Cp) mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
HQ859946.1 Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0809-Tuaran-
Malaysia-2 coat protein (Cp) mRNA, complete cds Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0809-
100 (%) 99 (%)
Tuaran-Malaysia-3 coat protein (Cp) mRNA, complete cds
HQ859927.1
Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0708-Gondol-
Indonesia-2 coat protein (Cp) mRNA, complete cds
100 (%) 99(%)
HQ859928.1
Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0708-Gondol-
Indonesia-4 coat protein (Cp) mRNA, complete cds Tiger grouper Nervous Necrosis Virus isolate TGNNV0708-Gondol-
Indonesia-6 coat protein (Cp) mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
HQ859924.1
Mouse grouper Nervous Necrosis Virus isolate MGNNV0708-Gondol- Indonesia-3 coat protein (Cp) mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
DQ116038.1
Redspotted grouper nervous necrosis virus isolate GMNNV-Korea coat protein
mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
AY690596.1
Redspotted grouper nervous necrosis virus coat protein
mRNA, complete cds
100 (%) 99 (%)
FJ789784.1
Redspotted grouper nervous necrosis virus segment RNA2, complete sequence
100 (%) 99 (%)