- Tế bào lỏch cỏ mỳ dũng GS
2.2.1.2. Phương phỏp phõn lập virus nuụi cấy trờn tế bào
Theo phương phỏp Q.W. Qin và cs. (2006)
Trước khi sử dụng, tế bào được hoạt húa trong chai nuụi cấy với mụi trường Leibovitz’s L-15 cú bổ xung 10% huyết thanh bào thai bờ (FCS) cho tới khi tế bào mọc thành một lớp ở đỏy chai nuụi cấy với độ bao phủ khoảng 90%. Loại bỏ mụi trường trong chai nuụi cấy và rửa lần 1 bằng cỏch trỏng tế bào với L-15 khụng cú FCS. Sau đú rửa bổ sung Leibovitz’s L-15 từ 1-2 tiếng rồi loại bỏ hoàn toàn mụi trường L-15 trước khi lõy nhiễm dịch mẫu.
Mẫu bệnh phẩm sẽ được lõy nhiễm trờn tế bào GS 01 đó hoạt húa. Hỳt 1ml dịch mẫu để lỏng hết trờn toàn bộ bề mặt tế bào của chai nuụi 75 cm2, lắc đều để virus tiếp xỳc với toàn bộ bề mặt chai.
Ủ từ 1-2 tiếng ở 27oC, cứ 15 phỳt lại lắc qua lắc lại nhẹ chai nuụi cấy 1 lần để nhằm trải đều virus trờn bề mặt tế bào trong chai. Bổ xung thờm mụi trường L-15 chứa 10% FCS.
Mẫu đối chứng chỉ cú tế bào GS và mụi trường L-15, 10% FCS.
Tế bào được nuụi trong tủ ấm ở nhiệt độ 27oC, 5% CO2. Bắt đầu theo dừi sự xảy ra của hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE-cytopathic effect) mỗi ngày. Khi CPE đạt khoảng 90-95% thỡ thu dịch virus khỏi chai nuụi cấy rồi ly tõm thu dịch nổi cú chứa virus ở 10 000 vũng/phỳt trong 30 phỳt.
Dịch virus được cất giữ như dịch mẫu cho tỏch chiết RNA và cỏc qui trỡnh khỏc. Bảo quản ở -18oC.
* Phương phỏp chuẩn độ Reed-Muench
lg TCID50= lgA+ x1lgf lg TCID50= lgA+ x2lgf
Trong đú: f là hệ số pha loóng
A1: tỷ lệ cận trờn cú bệnh tớch B1: tỷ lệ cận dưới cú bệnh tớch
A: độ pha loóng với tỷ lệ cận trờn cú bệnh tớch B: độ pha loóng với tỷ lệ cận dưới cú bệnh tớch