- Tế bào lỏch cỏ mỳ dũng GS
2.2.2.2.Phương phỏp tạo tế bào khả biến mang genT
Theo phương phỏp Sambrook J, Russel DW (2001).
Biến nạp là quỏ trỡnh chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào nhận. Cơ chế biến nạp bao gồm việc thay đổi cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn để DNA dễ dàng chui vào tế bào nhận. Những tế bào cú khả năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai gọi là tế bào khả biến. Quỏ trỡnh biến nạp vào tế bào E.coli
DH5α gồm hai giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
2.2.2.3. Phương phỏp tỏch chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
* Cỏc bước tiến hành
1. Chọn cỏc khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh nuụi trong 2 ml mụi trường LB lỏng cú bổ sung khỏng sinh Ampicilin với nồng độ 100àg/ml, nuụi lắc qua đờm ở 37°C, 200 vũng/phỳt.
2. Hỳt 1,5ml dịch khuẩn E.coli cho vào eppendorf. Ly tõm 12.000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại dịch và thu sinh khối tế bào.
3. Bổ sung 150 àl Sol I (Glucoza 50mM; Tris-HCl 50mM, pH = 8,0; EDTA 10mM, pH = 8,0), trộn đều bằng mỏy vortex.
4. Bổ sung 150 àl Sol II (NaOH 200mM; SDS 1%), đảo đều dung dịch bằng tay trỏnh vún cục. Khụng vortex vỡ sẽ làm lẫn plasmid với DNA genom.
5. Bổ sung 150 àl Sol III (Potasium acetat 3M, pH = 5,5 ), đảo nhẹ bằng tay trỏnh hiện tượng kết tủa cục bộ, dung dịch sẽ cú màu trắng sữa.
6. Bổ sung 450àl Chloroform : Isoamyl Alcohol ( 24:1), đảo nhẹ, giữ ở nhiệt độ phũng trong 3 phỳt.
7. Ly tõm 12.000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 4º C, hỳt lớp dịch phớa trờn chuyển sang eppendorf 1,5ml mới.
8. Bổ sung 450 àl Isopropanol, đảo nhẹ nhàng ngay rồi để lạnh 10 phỳt. 9. Ly tõm 12000v/p trong 15 phỳt. Loại bỏ dịch nổi thu cặn bờn dưới. 10. Bổ sung 500 àl ethanol 70% để rửa cặn DNA, loại bỏ cỏc thành phần phụ.
Ly tõm 12.000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 4°C. Đổ bỏ dịch, thu cặn. 11. Làm khụ cặn trong box.
12. Bổ sung 40 àl TE-RNase (100 àg/ml).
13. Ủ ở bể ổn nhiệt 37ºC trong 1 giờ để loại bỏ hoàn toàn RNA. 14. Kiểm tra điện di trờn gel agarose 1%.
2.2.2.4. Cắt kiểm tra vector tỏi tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI
Phản ứng cắt DNA bằng enzym giới hạn cú sự tham gia của cỏc thành phần: dung dịch đệm cho enzym hoạt động, DNA (50ng), enzym giới hạn, nước khử ion.
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều. Phản ứng được thực hiện ở 37°C trong 1-3 giờ. Kiểm tra điện di trờn gel agarose 1%.